Утверждены
Минздравом СССР
8 июня 1989 г. N 5026-89
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ТРИФУМИНА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ В ОВОЩАХ,
ФРУКТАХ, ЗЕРНЕ, ПОЧВЕ И ВОДЕ МЕТОДОМ
ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
--------------------------------
<*> Разработаны М.В. Письменной,
М.А. Клисенко (ВНИИГИНТОКС).
Краткая
характеристика препарата и его
основных метаболитов. Трифумин
(NF-114, трифмин), действующее начало 4-хлор-альфа, альфа, альфа-трифтор-
N-1(III-имидазол-1-ил)-2-пропоксиэтилиден-0-толуидин. Брутто
- формула
C H ClF N O.
Молекулярная масса 345,75.
Общепринятое название -
15 15
3 3
трифлумизол.
Кристаллический порошок без
запаха, т. пл.
63,5 °C,
растворимость (г/100 мл
при 25 °C): в воде (pH 5,3) - 0,0015, ацетоне -
261, хлороформе - 185, н-гексане - 4,4,
метаноле - 50; давление паров 1,9 x
-4
10 Па
(25 °C). В
водных растворах наиболее
устойчив
при pH
6. С
увеличением температуры
гидролиз значительно ускоряется.
Временные МДУ в
огурцах,
томатах, яблоках 0,1
мг/кг. Содержание трифумина в винограде и
землянике не
допускается.
Основные
метаболиты трифумина: 1-(4-хлор-1-трифторметилфенил)-2-
пропоксиамидин,
(ТМ-6-1). Белые кристаллы
без запаха, растворимы
в
метаноле, н-гексане, дихлорметане.
Брутто - формула C H ClF N O.
12 14 3 2
Молекулярная масса 294,6. N-(4-хлор-2-трифторметилфенил)-1-
пропоксиацетамид, (ФД-1-1) - бесцветная маслянистая
жидкость, растворима в
метаноле, н-гексане, дихлорметане.
Брутто - формула C H ClF NO .
12 13 3 2
Молекулярная
масса 295,7.
Принцип метода. Метод основан на экстракции
трифумина и его метаболитов
из пробы
органическим растворителем, концентрировании, очистке на слое
Al O после перераспределения веществ в смесь этанол - 0,02 н HCl (1:1),
2 3
последующем
подщелачивании раствора до pH 7,5 и экстракции их в н-гексан.
Тонкослойнохроматографическое определение проводят в тонком слое пластинок
"Алуфол" или "Силуфол",
используя в качестве проявляющего реагента 1-нафтол
после термического разложения веществ на пластинке
до ароматического амина
и диазотирования, либо
реагент на основе бромфенолового синего с AgNO .
3
Первый вариант
проявления позволяет обнаружить трифумин и его
метаболиты,
второй - только трифумин.
Метрологическая характеристика метода.
Нижний предел обнаружения по реакции азосочетания 0,2
мкг (на пластинках "Алуфол"), 3 мкг (на
пластинках "Силуфол"); по реакции с бромфеноловым синим 1 мкг (на пластинках "Силуфол"). Метрологические характеристики определения трифумина в воде, почве, овощах, фруктах и зерне приведены
в таблице 141.
Таблица 141
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА
┌────────┬──────────┬─────────────┬────────────┬─────────────┬────────────┐
│Опреде- │Иссле- │Нижний
предел│ Среднее │Доверительный│ Число
│
│ляемое │дуемый │определения, │ значение
│ интервал │параллельных│
│вещество│объект
│ мг/кг или │определения,│среднего
при │определений,│
│ │ │ мг/л <*> │
% │ p = 0,95, % │ n
│
├────────┼──────────┼─────────────┼────────────┼─────────────┼────────────┤
│Трифумин│Вода
│0,001 <**> │86 │+/- 8,4 │7 │
│ │Овощи, │0,004 │92 │+/- 2,9 │30 │
│ │фрукты │ │ │ │ │
│ │Зерно │0,008 │91 │+/- 10,4 │7 │
│ │Почва │0,004 │91 │+/- 8,9 │7 │
│ФМ-6-1 │Вода │0,001 <**> │92 │+/- 7,9 │8 │
│ │Овощи, │0,004 │95 │+/- 2,1 │30 │
│ │фрукты │ │ │ │ │
│ │Зерно │0,008 │90 │+/- 8,7 │7 │
│ │Почва │0,004 │96 │+/- 4,2 │7 │
│ФД-1-1 │Вода │0,001 <**> │85 │+/- 9,1 │8 │
│ │Овощи, │0,004 │92 │+/- 2,5 │30 │
│ │фрукты │ │ │ │ │
│ │Зерно │0,008 │88 │+/- 10,8 │7 │
│ │Почва │0,004 │87 │+/- 9,0 │7 │
└────────┴──────────┴─────────────┴────────────┴─────────────┴────────────┘
--------------------------------
<*> Приведены данные при
обнаружении по реакции азосочетания на пластинках
"Алуфол".
<**> Предел определения в воде
можно снизить в 2,5 раза (до 0,0004 мг/л), увеличив объем пробы, взятой для
анализа, до 500 мл.
Избирательность метода. Применение двух
проявляющих реагентов, позволяющих обнаруживать трифумин
по различным функциональным группам, дает возможность идентифицировать его в присутствии
хлор-, фосфорсодержащих пестицидов, триазинов,
производных фенилмочевины.
Реактивы и материалы. Ацетон х.ч. н-Гексан х.ч.
Сульфат натрия безводный, ч. Хлороводородная кислота х.ч., концентрированная и 0,01 и 0,02 н водные растворы,
приготовленные из фиксанала. Гидроксид натрия х.ч., 0,01 н водный раствор. Гидроксид
калия ч. Хлорид натрия ч.д.а. 1-Нафтол ч.д.а. Бромфеноловый синий
индикатор ч.д.а. Нитрат серебра ч.д.а.
Этанол 96-процентный, стандартные пластинки "Алуфол",
"Силуфол" (20 x 20 см), "Хемапол", ЧСФР. Индикаторная бумага
универсальная "Реахим" или "Лахема", "Хемапол",
ЧСФР. Оксид алюминия для хроматографии. Фильтры легкофильтрующие
"красная лента". Препарат трифумин,
метаболиты трифумина ФМ-6-1 и ФД-1-1. Основные
стандартные растворы трифумина и его метаболитов с
концентрацией на 1000 мкг/мл готовят растворением 25 мг каждого вещества в 5 мл
ацетона. Объем раствора доводят в мерных колбах н-гексаном
до 25 мл. Трифумин в растворе устойчив при хранении в
течение 1,5 мес., метаболиты - 3 мес. Рабочий стандартный раствор - смесь трифумина и его метаболитов. Вносят 5 мл основного
стандартного раствора каждого вещества в мерную колбу вместимостью 50 мл и
доводят объем раствора н-гексаном до метки.
Концентрация в смеси каждого вещества 100 мкг/мл. Растворы устойчивы в
холодильнике в течение 10 дней. Проявляющие реагенты: N 1 - а - к смеси из 46
мл воды и 4 мл концентрированной хлороводородной
кислоты прибавляют 1 г нитрита натрия; б - к раствору 2,8 г гидроксида калия в
50 мл воды прибавляют 0,1 г 1-нафтола. Проявляющие реагенты применяют
свежеприготовленными; N 2 - а - 0,05 г бромфенолового
синего растворяют в 10 мл ацетона и доводят объем раствора до 100 мл
1-процентным водно-ацетоновым (вода-ацетон 1:3) раствором нитрата серебра; б -
5-процентный водный раствор уксусной кислоты по объему (5 мл уксусной кислоты и
95 мл воды). Растворы устойчивы в течение 2 мес.
Приборы и посуда. Аппарат для
встряхивания. Дробилка почвенная лабораторная или ступка. Ротационный вакуумный
испаритель. Колбы мерные вместимостью 25; 50 и 100 мл, конические вместимостью
50; 100 и 250 мл; грушевидные вместимостью 50 и 100 мл ОКШ 50-14/23ТС. Сита
почвенные. Воронки химические, делительные на 50; 250 и 500 мл. Пробирки мерные
на шлифах вместимостью 5 мл. Пипетки на 0,1; 0,2; 1; 5 и 10 мл.
Подготовка пластинок для хроматографии.
Пластинки "Алуфол" или "Силуфол" перед нанесением пробы промывают в хроматографической камере ацетоном, давая растворителю
подняться до верхнего края пластинки. Отмечают верхний край пластинки, дают растворителю
испариться с пластинки и прогревают ее 20 мин. при 60 °C. При хроматографировании линия старта должна быть со стороны
нижнего края пластинки.
Ход анализа. Экстракция. К 200 мл воды прибавляют 5 г NaCl,
перемешивают, прибавляют 50 мл ацетона, а затем переносят в делительную воронку
и трижды экстрагируют н-гексаном порциями по 50 мл,
встряхивая каждый раз в течение 3 мин. Верхний органический слой сливают в
колбу для отгонки, фильтруя через слой безводного сульфата натрия (10 - 15 г),
насыпанного на легкофильтрующий фильтр "красная
лента", вложенный в фильтровальную воронку. Упаривают растворитель
до 0,5 мл под вакуумом на ротационном испарителе при температуре бани не более
45 °C (в фарфоровых чашках при комнатной температуре). Остаток упаривают до 0,2
- 0,3 мл при комнатной температуре и хроматографируют.
Пробу количественно наносят на пластинку, ополаскивая колбу н-гексаном (3 - 4 раза по ~ 0,1 мл).
К 50 г почвы, измельченной до 0,5 - 1 см,
овощей, фруктов, к 25 г измельченного до 2 - 3 мм и отсеянного от муки зерна
прибавляют 60 мл (к зерну - 40 мл) смеси н-гексан-ацетон
(7:3) и экстрагируют в течение 30 мин. на аппарате для встряхивания. Экстракт
сливают в колбу для отгонки растворителей, фильтруя через слой безводного
сульфата натрия (10 г) на фильтровальной воронке с небольшим ватным тампоном.
Приливают к пробе новую порцию смеси растворителей, повторяют экстракцию.
Экстракты объединяют, сливая через слой безводного сульфата натрия. Если
экстракт мутный, добавляют в него безводный сульфат натрия (10 - 15 г), а затем
фильтруют через небольшой ватный тампон. Упаривают экстракт до 0,5 мл под
вакуумом на ротационном испарителе при температуре бани не более 45 °C. Остаток
упаривают досуха при комнатной температуре и очищают от сопутствующих веществ.
Очистка от сопутствующих веществ. Оксид
алюминия 2 куб. см (2,5 г) насыпают на легкофильтрующий
фильтр "красная лента", вложенный в небольшую фильтровальную воронку,
промывают 10 мл 0,01 н HCl, элюат
отбрасывают. К сухому остатку в колбе прибавляют 4 мл смеси этанол - 0,02 н HCl (1:1), ополаскивают этим раствором колбу и фильтруют
его через подготовленный слой оксида алюминия. Колбу несколько раз ополаскивают
0,01 н HCl (общий объем 10 мл), сливая каждый раз
смывы через слой оксида алюминия. Оксид алюминия промывают 5 мл воды и
присоединяют к фильтрату. К полученному фильтрату прибавляют 50 мл воды,
нейтрализуют раствор 0,01 н NaOH и доводят до pH 7,5 (контроль по индикаторной бумаге). Полученный
раствор переносят в делительную воронку и 4 раза экстрагируют н-гексаном, предварительно насыщенным водой, порциями по 20
мл. Объединенные н-гексановые экстракты промывают 20
мл воды, воду отбрасывают, н-гексан сушат, сливая
через слой безводного сульфата натрия на воронке. К экстракту прибавляют 20 мл
ацетона и упаривают до 0,5 мл под вакуумом, как описано выше для воды.
Условия
хроматографирования при
методе ТСХ. На пластинку "Алуфол",
промытую ацетоном,
с помощью капилляра
или микропипетки наносят пробу,
ополаскивая
колбу 3 - 4 раза небольшими количествами (0,1 мл) н-гексана.
На
эту же пластинку
наносят 0,05 - 0,2 мл рабочего стандартного раствора смеси
трифумина и его
метаболитов. Пластинку хроматографируют в
подвижной фазе
гексан-ацетон
(3:1) при температуре
в помещении 20
- 22 °C или
гексан-ацетон
(4:1) при температуре
выше 22 °C.
После того как фронт
растворителя поднимется
на 10 см, пластинку вынимают из
камеры, отмечают
линию фронта
и оставляют на
несколько минут на
воздухе до испарения
растворителя. Затем
пластинку слегка опрыскивают
0,01 н раствором HCl
и
прогревают в
сушильном шкафу при температуре
160 - 170 °C в течение 1 ч.
После охлаждения
ее помещают в
камеру для опрыскивания
и орошают
проявляющим реагентом
N 1 - сначала реактивом а и сразу же реактивом б.
Трифумин и его
метаболиты проявляются в виде
красных пятен. Величина R
f
трифумина,
ФМ-6-1, ФД-1-1 и
подвижной фазе гексан-ацетон (3:1)
соответственно 0,23; 0,49; 0,82; в ПФ гексан-ацетон
(4:1) - соответственно
0,17; 0,37;
0,78. Для этой
реакции можно также использовать
пластинки
"Силуфол", но чувствительность обнаружения будет ниже.
При
использовании проявляющего реагента на основе бромфенолового
синего
(реагент N 2)
пробу наносят на пластинку "Силуфол", хроматографируют в ПФ
гексан-ацетон
(2:1). При проявлении
орошают сначала реактивом N
2 а,
прогревают при 100 °C в течение 5 мин. и орошают
реактивом N 2 б. Трифумин
проявляется в
виде синего пятна
на желтом фоне.
Величина R 0,35;
f
метаболиты ФМ-6-1
и ФД-1-1 в
малых концентрациях (до 10 мкг)
не
обнаруживаются,
при больших концентрациях они могут проступать в виде более
светлых, чем
фон, пятен. Величина R ФМ-6-1 и
ФД-1-1 соответственно равна
f
0,61 и 0,93.
Обработка результатов анализа. Количественное
определение трифумина и его метаболитов проводят
путем сравнения интенсивности окраски и размера пятен проб с пятнами
стандартных растворов на одной пластинке. Прямо пропорциональная зависимость
площади пятен от концентрации препаратов (при одинаковом диаметре пятна,
нанесенного на старте) наблюдается в пределах 0,2 - 5 мкг (пластинки "Алуфол", проявляющий реагент N 1); 1 - 20 мкг
(пластинки "Силуфол", проявляющий реагент N
2). При больших концентрациях следует анализировать аликвотную часть экстракта параллельной
пробы.
Концентрацию трифумина
и его метаболитов (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
A
X = -,
P
где:
A - количество трифумина
(или метаболита), найденное в хроматографируемой
пробе, мкг;
P - навеска анализируемой пробы, г.
Требования безопасности. Соблюдать
требования безопасности, принятые для работы с пестицидами и
легковоспламеняющимися жидкостями.