Утверждаю
Заместитель начальника Главного
санитарно-эпидемиологического
управления Минздрава СССР
А.И.ЗАИЧЕНКО
10 июля 1987 г. N 4387-87
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ВИТАМИНА C В ПИЩЕВЫХ
ПРОДУКТАХ
Разработана в Институте питания АМН СССР
лабораторией витаминизации пищевых продуктов.
Метод визуального титрования витамина С является наиболее простым, доступным и широко
используется как в нашей стране, так и за рубежом для определения этого
витамина в пищевых продуктах, не содержащих естественных пигментов, мешающих
визуальному установлению конца титрования.
Метод прошел широкую апробацию в
различных лабораториях научных и практических учреждений (лаборатории пищевых
отделов СЭС, кафедр гигиены питания медицинских институтов, лабораторий
различных отраслей пищевой промышленности), одобрен Минздравом СССР и
рекомендован для практического использования Междуведомственной комиссией по
составлению "Таблиц химического состава пищевых продуктов".
Принцип метода
Метод основан на способности аскорбиновой
кислоты (АК) окисляясь количественно восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенолят
натрия. АК экстрагируют раствором метафосфорной кислоты и титруют
2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия до установления светло-розовой окраски.
Дегидроаскорбиновую кислоту в АК восстанавливают цистеином, для отделения АК от
редуцирующих соединений, присутствующих в пищевых продуктах, подвергающихся
тепловой обработке и длительно хранившихся, экстракты обрабатывают
формальдегидом при определении pH.
Оборудование
Потенциометр; термостат водяной на 37 °С; весы лабораторные общего назначения с наибольшим
пределом взвешивания 200 г, поверочной ценой деления не более 0,5 мг; весы
лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 500 г,
поверочной ценой деления не более 50 мг; гомогенизатор.
Посуда
Ступка с пестиком; воронки фильтровальные
диаметром 5 - 7,5 см; колбы мерные вместимостью 100, 500 и 1000 куб. см; колбы
конические вместимостью 50 и 100 куб. см; микробюретки на 2 куб. см с ценой
деления 0,01 куб. см; пипетки градуированные на 1, 2,
5 и 10 куб. см; цилиндры мерные на 100 и 200 куб. см; стаканы на 50 и 100 куб.
см.
Реактивы
1. Аскорбиновая кислота (Госфармакопея СССР, X изд., ст. 6).
2. 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия.
3. Калий фосфорнокислый двузамещенный.
4. Метафосфорная кислота.
5. Натрий уксуснокислый.
6. Серная кислота, ос.ч.
7. Уксусная кислота ледяная.
8. L-цистеин HCl.
9. Формальдегид 36 - 38%.
10. Этилендиаминтетрауксусная кислота.
11. Бумага фильтровальная.
Приготовление
реактивов
1. Раствор метафосфорной кислоты 6% и
3%. Растирают в ступке 60 г HPO
3
и растворяют
в 940 куб. см дистиллированной воды
без нагревания. При
стоянии раствор HPO
медленно гидролизуется до H
PO , поэтому свежий
3 3 4
раствор готовят
еженедельно. 3% раствор HPO
готовят в день проведения
анализа из 6%
раствора. 3
2. Стандартные растворы аскорбиновой
кислоты (АК) с массовой концентрацией 1 мг/куб. см и 0,1 мг/куб. см. Растворяют
0,1000 г АК в мерной колбе на 100 куб. см в 3% растворе метафосфорной кислоты и
доводят тем же раствором кислоты до метки (раствор с массовой концентрацией 1
мг/куб. см). Для приготовления раствора 0,1 мг/куб. см 10 куб. см раствора АК с
концентрацией 1 мг/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и
доводят до метки 3% раствором метафосфорной кислоты. Растворы неустойчивы, их
приготовляют непосредственно перед применением.
3. Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята
натрия 0,04%. Растворяют 0,2 г 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия в 300 куб. см
горячей свежекипяченой (в течение 30 мин.) дистиллированной воды, фильтруют
через складчатый фильтр в мерную колбу вместимостью 500 куб. см и промывают
фильтр горячей водой. После охлаждения раствор доводят до метки охлажденной
свежекипяченой дистиллированной водой. Срок годности раствора при хранении в
холодильнике - не более 2 дней.
Установка титра
раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия: в две конические колбы наливают по
9 куб. см 3% раствора метафосфорной кислоты и по 1 куб. см раствора АК с
массовой долей 0,1 мг/куб. см и быстро титруют раствором
2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до светло-розовой окраски, не исчезающей в
течение 10 - 15 с. Таким же образом титруют 10 куб. см 3% раствора
метафосфорной кислоты (контроль
на реактивы). Поправку к титру раствора вычисляют по формуле:
Т = 0,10 / (V - V ),
1
где:
0,10 - количество АК в 1,0 куб. см
стандартного раствора, мг;
V
- объем раствора
2,6-дихлорфенолиндофенола,
затраченный на
титрование
стандартного раствора АК, куб. см;
V
- объем 2,6-дихлорфенолиндофенола, затраченный
на титрование 3%
1
раствора
метафосфорной кислоты, куб. см.
4. Раствор L-цистеина HCl
с массовой концентрацией 50 мг/куб. см. Раствор приготовляют в день применения.
5. Ацетатный буфер (рН - 4,0). Растворяют
49,8 г уксуснокислого натрия в 70 куб. см дистиллированной воды и, добавляя
ледяную уксусную кислоту (около 100 куб. см), потенциометрически
доводят рН до 4,0.
6. Раствор серной кислоты: к 50 куб. см
дистиллированной воды осторожно добавляют 50 куб. см концентрированной серной
кислоты.
7. Раствор этилендиаминтетрауксусной
кислоты (ЭДТА) с массовой концентрацией 15%.
8. Раствор двузамещенного
фосфорнокислого калия с массовой концентрацией 45%.
Ход определения
Интервал определяемых концентраций АК
составляет 0,05 - 0,12 мг в объеме экстракта (от 1,0 до 10 куб. см), взятого на
титрование. Величину навески продукта и последующее разведение рассчитывают
исходя из интервала указанных концентраций.
Навеску исследуемого
материала, взятую из средней пробы (1 - 50 г в
зависимости от
предполагаемого количества витамина
С), помещают в
фарфоровый стакан,
в который налито
30 - 50
куб. см 6% HPO
, и
3
гомогенизируют полученный гомогенат, включая
мякоть, количественно
переносят в
мерную колбу или цилиндр
вместимостью 100 - 200
куб. см,
доводят до
метки 3% HPO , перемешивают и фильтруют через фильтровальную
3
бумагу. При
анализе сухих продуктов гомогенат после
измельчения настаивают
в течение 10
- 15 мин. При
определении витамина С в
жидких объектах
необходимое
количество материала отсеивают или отмеряют
в мерную колбу
вместимостью 100
куб. см и доводят до метки 3% HPO .
3
Экстрагирование проводят быстро, полученные экстракты сразу
используют
для анализа.
При экстрагировании АК из
продуктов, расфасованных в металлическую
тару, или из продуктов с
высоким содержанием железа, навеску образца
(1 -
25 г)
гомогенизируют в 6% раствора HPO , переносят в
цилиндр вместимостью
3
100 куб. см,
этим же раствором кислоты и доводят
объем до 50
куб. см,
перемешивают.
Через 10 мин. прибавляют
30 куб. см ацетатного буферного
раствора и 10
куб. см раствора ЭДТА, доводят до
метки 3% раствором HPO ,
3
перемешивают и
фильтруют.
Определение АК
В
две конические колбы вносят пипеткой от 1 до 10 куб. см
экстракта,
доводят объем
3% раствором HPO до
10 куб. см и титруют раствором 2,6-
3
дихлорфенолиндофенола
до слабо-розового окрашивания,
не исчезающего в
течение 10
- 15 с. Таким же образом титруют 10 куб. см 3%
раствора HPO
3
(контроль на
реактивы - V ).
0
При содержании в продукте редуцирующих
соединений контрольное испытание
проводят следующим
образом: в коническую
колбу помещают такой же объем
экстракта, как при
определении АК, прибавляют равный ему объем ацетатного
буфера и раствор
формальдегида в объеме, равном половине объема буферного
раствора, перемешивают,
закрывают колбу пробкой, оставляют на 10 мин. и
титруют
раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола (V ).
0
Массовую долю АК в мг на 100 г продукта
вычисляют по формуле:
Т х (V - V ) х V х 100
0 1
Х =
-----------------------,
(1)
V
х а
2
где:
Т - титр раствора
2,6-дихлорфенолиндофенола;
V -
объем 2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованного
на титрование
испытуемого
раствора (среднее из двух параллельных определений), куб. см;
V
- объем раствора
2,6-дихлорфенолиндофенола,
израсходованного на
0
титрование при
контрольном испытании, куб. см;
V
- общий объем экстракта,
полученный при экстрагировании пробы, куб.
1
см;
V -
объем экстракта, взятый на титрование, куб. см;
2
а - масса навески, г;
100 - пересчет на 100 г продукта.
Вычисление проводят до первого
десятичного знака. За конечный результат принимают среднее арифметическое двух
параллельных определений. Расхождение между двумя параллельными определениями
не должно превышать 5% от среднего арифметического значения.
Определение общего
содержания витамина С (аскорбиновая
кислота + дегидроаскорбиновая кислота) (АК + ДАК)
В коническую
колбу наливают 2 - 20
куб. см экстракта
(для
проведения двух
параллельных определений) (V ), доводят pH до 7,2
- 7,4
3
(потенциометрически)
45% раствором двузамещенного фосфорнокислого
калия, добавляют
раствор цистеина в
таком количестве, чтобы
его
массовая
концентрация приблизительно в 300
раз превышала предполагаемое
содержание
ДАК, и
ставят колбу в термостат
при температуре 37 °С на 30
мин. Массовую
долю цистеина в мг, добавляемую
к экстракту, рассчитывают
по формуле:
К х а х V х 300 К х а х V х 3
3 3
Х = ---------------- =
--------------, (2)
100 х V V
1 1
где:
К - массовая
концентрация АК в продукте, определенная
по формуле (1),
мг на 100 г
продукта;
V -
объем экстракта, взятый
на восстановление ДАК в АК,
куб. см;
3
остальные
обозначения те же, что в формуле (1).
После
термостатирования раствор
быстро охлаждают до комнатной
температуры,
доводят потенциометрически рН
раствора до 0 - 0,5 раствором
серной кислоты
и измеряют объем
(V ). К части
раствора (с примерной
4
массовой концентрацией АК
0,1 мг) (V ) прибавляют
формальдегид до
2
получения массовой доли
3%, закрывают колбу
пробкой и через
8 мин.
титруют
раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до
слабо-розового окрашивания,
не исчезающего в течение 10 - 15 с.
Массовую долю витамина С
в мг на 100 г продукта вычисляют по формуле:
Т х V х V х V х
100
1 4
Х =
---------------------,
(3)
V х V х
а
2 3
где:
V -
объем раствора после доведения рН до 0 - 0,5, куб. см;
4
остальные обозначения те же, что в формулах
(1) и (2).
Вычисление проводят до первого
десятичного знака. За результат принимают среднее арифметическое двух
параллельных определений. Расхождение между двумя параллельными определениями
не должно превышать 8% от среднего арифметического значения.