Утверждены
Минздравом СССР
8 июня 1987 г. N 4383-87
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ 2,4-Д И АМИННОЙ СОЛИ 2,4-Д В ПОЧВЕ
МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
--------------------------------
<*> Разработаны Э.И. Бабкиной, Л.Б.
Алексеевой, Ж.Н. Трублаевич, Г.А. Борисовой (ИЭМ НПО
"Тайфун"), Н.П. Фрей (Калужская областная
проектно-изыскательская станция химизации сельского хозяйства).
Краткая характеристика препарата. Брутто
- формула
2,4-дихлорфеноксиуксусной
кислоты C H O Cl N. Молекулярная
масса 266,1.
10 18 3 2
Общепринятое название - аминная
соль 2,4-Д, 2,4-ДА, 2,4-ДМА.
Бесцветное
гигроскопическое
кристаллическое вещество, т. пл. 85 - 87 °C. Растворимость
в воде
при 20 °C 200
г/л. Хорошо растворима в
этаноле, метаноле,
практически нерастворима в
углеводородах. Применяется в качестве гербицида
для уничтожения
сорняков в посевах зерновых культур, кукурузы,
многолетних
злаковых трав, а
также для уничтожения нежелательной древесной поросли.
2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д)
в виде солей и эфиров используется в качестве гербицида. ПДК в почве: аминная соль 2,4-Д - 25 мг/кг, 2,4-Д - 0,1 мг/кг.
Принцип метода. Метод
основан на экстракции и одновременном гидролизе 2,4-ДА до свободной феноксикислоты 2,4-Д 1 н раствором серной кислоты при
одновременном перераспределении 2,4-Д в диэтиловый
эфир, последующем перераспределении 2,4-Д в 1 н раствор едкого натра, очистке
последнего хлороформом, перераспределении 2,4-Д в кислый раствор и экстракции
последнего диэтиловым эфиром, концентрировании
экстракта и этерификации сухого остатка с помощью этилового и (или) бутилового спиртов в присутствии концентрированной серной
кислоты. Количество этилового и бутилового эфиров 2,4-Д определяется методом
газожидкостной хроматографии с использованием ДЭЗ.
Метрологическая характеристика метода.
Предел обнаружения 0,0001 - 0,0002 мкг, предел определения в почве 0,01 - 0,02
мг/кг. Доверительный интервал определения 2,4-Д в почве составляет 90 +/- 15%
при концентрациях 10 - 100 мг/кг и 85 +/- 20% при концентрациях 0,1 - 10 мг/кг,
p = 0,95, n = 4 и описанных хроматографических
условиях с использованием фазы SE-30.
Определению не мешают гербициды ряда
карбоновых и феноксиуксусных кислот (далапон, 2М-4Х, трихлорацетат натрия).
При использовании
неполярной фазы SE-30 время удерживания этилового эФира
2,4-Д совпадает со временем удерживания альфа-ГХЦГ, однако в процессе
экстракции гербицидов и последующей очистки экстрактов изомеры ГХЦГ не
переходят в эфирный экстракт и не мешают определению 2,4-Д. Время удерживания
бутилового эфира 2,4-Д совпадает со временем удерживания 2,4'-ДДЭ, однако также
в процессе экстракции и очистки экстрактов 2,4'-ДДЭ не переходит в эфирный экстракт, поэтому не мешает определению 2,4-Д.
Анализ 2,4-Д в виде
двух различных эфиров - этилового и бутилового - обусловлен тем, что среди
природных соединений почвы, воды и других объектов встречаются соединения, имеющие
время удерживания, совпадающее со временем удерживания одного из этих эфиров.
Реактивы и материалы. Азот особой
чистоты. Ацетон ч. или ч.д.а. Эфир диэтиловый (серный) медицинский, перегнанный. Серная
кислота х.ч., концентрированная, 1 н раствор. Гидроксид
натрия (едкий натр) ч., 1 н раствор. Хлороформ перегнанный. Этиловый спирт ректиф., перегнанный. Сульфат натрия безводный ч.д.а., 10-процентный раствор. Спирт бутиловый ч.д.а., перегнанный. Хлорид кальция ч., прокаленный. Вата
обезжиренная, промытая эфиром и гексаном. Наполнители
хроматографической колонки: хроматон
N-AW-DMCS (0,125 - 0,160 или 0,160 - 0,200 мм) или N-AW-HMDS, пропитанный
неподвижной фазой SE-30 (5%) или альтернативной фазой XE-60 (5%),
2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты х.ч. или чистоты не
менее 95%.
Приборы и посуда. Газовые хроматографы
"Цвет", "Газохром", ЛХМ-80 или
другие с ДЭЗ, ДПР. Колонки стеклянные длиной 1 и 1,5 м, внутренним диаметром 3
мм. Микрошприцы на 1 или 10 мкл.
Термометр (0 - 100 °C). Колбы: плоскодонные конические на 250 мл с притертыми
пробками или резиновыми, обернутыми в фольгу; мерные на 25; 50 и 100 мл.
Делительные воронки на 25; 30 и 250 мл. Мерные цилиндры вместимостью 50 и 100
мл. Пробирки градуированные с притертыми пробками на
10 и 20 мл. Воронки химические диаметром 4 и 7 - 12 см. Микропипетки на 0,2; 1;
2 и 5 мл. Ротационный испаритель. Центрифуга. Аппарат для встряхивания.
Сушильный шкаф. Весы аналитические. Плитка электрическая с закрытой спиралью на
800 Вт. Баня водяная.
Подготовка к определению. Приготовление растворов 2,4-Д. Для приготовления раствора А 2,4-Д
(1 - 10 мг/мл) в стаканчике или бюксе взвешивают 0,1 - 1,0 г 2,4-Д с точностью
+/- 0,0002 г. Содержимое стаканчика или бюкса с помощью 10 - 20 мл ацетона
переносят в мерную колбу на 100 мл, доводят до метки ацетоном, тщательно
перемешивают и закрывают. Раствор хранят в течение полугода в
холодильнике.
Для приготовления раствора Б 2,4-Д (10 - 100, 1 - 10 или 4 - 40, 0,4 - 4,0 мкг/мл) из
мерной колбы с раствором А отбирают 0,2 - 1,0 мл и переносят в градуированную
пробирку на 20 мл или мерную колбу на 25 или 50 мл, добавляют необходимое
количество ацетона, тщательно перемешивают и закрывают. Хранят в холодильнике
не более месяца.
Приготовление стандартных (градуировочных) растворов этилового и бутилового эфиров
2,4-Д. В навески почвы (3 навески по 20 г), помещенные в бюксы, вносят по 4 мл
дистиллированной воды. Бюксы закрывают и оставляют на 20 - 28
ч, после чего в каждый бюкс вносят с помощью пипетки по 0,4 мл ацетонового
раствора 2,4-Д соответствующей концентрации так, чтобы в каждые серии навесок
было внесено, например, по 200, 20 и 2 мкг 2,4-Д. Содержимое бюксов перемешивают стеклянной палочкой в течение 2 - 3
мин., закрывают и оставляют на 20 - 28 ч. На следующий день бюксы
открывают и оставляют открытыми вдали от солнечных лучей и вентиляционных
устройств до воздушно-сухого состояния навески почвы (2 - 3 сут.).
После этого бюксы закрывают и навеску выдерживают в темном месте не менее
недели (но не более 2 недель), затем комочки почвы раздавливают и извлекают
2,4-Д, очищают экстракты, концентрируют их и проводят этерификацию.
Объединенные гексановые
экстракты этилового или (и) бутилового эфира 2,4-Д, полученные после извлечения
2,4-Д из соответствующих навесок почвы и последующей этерификации, используют в
качестве градуировочных (стандартных или эталонных)
растворов при определении ГЖХ. При анализе исследуемой пробы используют градуировочный раствор от той серии навесок, в которых
концентрация 2,4-Д близка к концентрации 2,4-Д в исследуемой пробе, которую
предварительно оценивают с помощью любого градуировочного
рабочего раствора этилового или бутилового эфира 2,4-Д.
Перед ГЖХ, в день хроматографирования,
из градуировочных растворов отбирают по 2 - 3 мл и
очищают концентрированной серной кислотой, добавляя ее по 0,5 - 0,8 мл так, как
описано ниже.
Градуировочные растворы, не очищенные серной кислотой, хранят не более 2 мес. в
холодильнике. Градуировочные растворы, очищенные
серной кислотой, хранению не подлежат.
При использовании в качестве эталонного эфира
2,4-Д, полученного после этерификации 2,4-Д, внесенной в образцы почвы,
аналогичной исследуемой, стандартное отклонение среднего значения определения
не превышает 25%.
Хранение проб почвы. Пробы
почвы, содержащие 2,4-Д и ее производные, хранят в воздушно-сухом состоянии в
упаковке, не содержащей пластмассы и полимерных материалов, не более 3 мес. В
местах хранения полевых проб закладывают почвенные пробы сравнения (ПС почвы) с
известным количеством аминной соли 2,4-Д или 2,4-Д.
Коэффициент учета условий хранения проб (КУ) находят по формуле:
КУ = С / С ,
1 2
где:
С -
содержание 2,4-Д или ее производного в ПС почвы в день закладки
1
полевых проб;
С -
содержание 2,4-Д или
ее производного в ПС почвы в
день начала
2
анализа полевой
пробы.
Ход анализа. Экстракция образцов почвы.
Навеску воздушно-сухой почвы (20 г) помещают в коническую колбу на 250 мл,
приливают 30 мл 1 н раствора серной кислоты. Затем вносят 1 мл ацетона,
тщательно перемешивают, закрывают колбу и оставляют на 1 ч. В течение этого
времени ее 2 - 3 раза энергично встряхивают вручную (1 - 2 мин). Затем
добавляют 60 мл этилового эфира и устанавливают на аппарате для встряхивания на
30 мин., после чего содержимое переносят в центрифужные
пробирки, центрифугируют <*> 3 мин. при 2000 об./мин. Жидкую часть сливают в делительную воронку на 250 мл, а
остаток из центрифужной пробирки переносят в исходную
колбу с помощью 10 мл 1 н раствора серной кислоты и 1 мл ацетона, энергично
встряхивают вручную (1 - 2 мин.), добавляют 20 мл эфира и встряхивают на
аппарате 15 мин. Содержимое колб переносят в центрифужные
пробирки, центрифугируют <*> (см. ранее) 3 мин. при частоте оборотов 2000
об./мин. Жидкую часть сливают
в делительную воронку к первой порции, остаток почвы удаляют.
--------------------------------
<*> При отсутствии центрифуги
раствор можно профильтровать, поместив фильтр в химическую воронку; во время
фильтрования воронку прикрывают фольгой для уменьшения испарения эфира.
Содержимое делительной воронки осторожно
встряхивают 1 - 2 мин., содержимому дают отстояться 10 - 15 мин., водный слой
отделяют и отбрасывают.
Очистка экстрактов. К эфирному экстракту
в делительной воронке добавляют 25 мл 1 н раствора гидроксида натрия и содержимое энергично встряхивают 1 - 2 мин. Эфирный
слой отделяют и отбрасывают, а к водно-щелочному добавляют 20 мл хлороформа и
энергично встряхивают в течение 1 - 2 мин., нижний хлороформный слой удаляют. К
очищенному экстракту добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты,
встряхивают, оставляют на 10 - 15 мин., затем добавляют 30 мл эфира, энергично
встряхивают 1 - 2 мин. и оставляют до разделения слоев. Водный слой сливают в
стаканчик или колбу. Неразрушившуюся эмульсию
оставляют в делительной воронке. Эфирный слой сливают через верх воронки,
фильтруя через сульфат натрия (10 - 15 г), помещенный в химическую воронку с
подложкой из обезжиренной ваты. Водный слой снова переносят в делительную
воронку и экстрагируют 20 мл эфира, также отделяя эфирный слой и фильтруя его
через ту же порцию сульфата натрия.
Этерификация. Осушенный эфирный экстракт
концентрируют на ротационном испарителе до 2 - 3 мл. Этот остаток с помощью
пипетки переносят в пробирку, колбу смывают 1 - 2 мл эфира и присоединяют к
эфирному экстракту в пробирке. С помощью пипетки с грушей эфир в пробирке
отдувают досуха, к сухому остатку добавляют сначала 1 мл спирта (этилового или
бутилового), а затем 0,5 мл концентрированной серной кислоты. Пробирку с реакционной смесью закрывают и помещают на кипящую
водяную баню так, чтобы в кипящей воде находилась 1/2 часть пробирки, и
нагревают при температуре около 100 °C в течение 20 мин. Затем содержимое
пробирок доводят до комнатной температуры, во все пробирки добавляют по 4 мл гексана и энергично их встряхивают. Отделять гексановый слой можно или в делительной воронке на 25 - 30
мл, или с помощью микропипетки на 5 мл, или просто слить гексановый
экстракт через край пробирки, оставляя нижний слой, который затем снова
встряхивают с новой порцией гексана (4 мл). К
объединенным гексановым экстрактам (8 - 9 мл)
приливают по 5 мл 10-процентного раствора сульфата натрия и энергично
встряхивают. Гексановый слой в делительной воронке
отделяют от водного, сливают его в пробирку на 10 мл, фильтруя его через
безводный сульфат натрия (3 - 5 г), помещенный в химическую воронку на подложку
из обезжиренной ваты. Аликвоту 4 мкл
из объема гексанового экстракта 3 - 5 мл вводят в
хроматограф. В случае появления на хроматограмме
пиков, время удерживания которых близко или совпадает с
временем удерживания этилового или бутилового эфиров 2,4-Д (последнее - в
случае приготовления градуировочных растворов), гексановый экстракт эфиров очищают серной кислотой. Для
этого к гексановому экстракту, помещенному в
делительную воронку, приливают 1 - 2 мл концентрированной серной кислоты и
осторожно встряхивают. Через 10 - 15 мин. слой кислоты отделяют, гексановый экстракт сливают в пробирку. Аликвоту
4 мкл из объема гексанового
экстракта 3 - 5 мл вводят в хроматограф.
Этерификацию различными спиртами проводят
двумя способами: либо экстракт делят на две части и каждую часть этерифицируют этиловым или бутиловым спиртом, либо этерифицируют экстракты, полученные из двух параллельных
навесок почвы. В любом случае соответствующий спирт добавляют к сухому остатку
после удаления из экстракта растворителя.
Если проведена очистка гексанового экстракта эфира 2,4-Д (этилового или
бутилового), полученного из исследуемой полевой пробы, очистке должен быть
подвергнут и соответствующий градуировочный раствор.
Условия хроматографирования.
Хроматограф ЛХМ-80 или аналогичный прибор с ДЭЗ. Температура, °C: колонки - 180
- 190, испарителя - 200 - 225, детектора - 230 - 250. Скорость потока
газа-носителя (азота) через колонку 60 мл/мин. Скорость протяжки ленты
самописца 600 мм/ч. Стеклянная колонка длиной 1 м, диаметром 3 мм заполнена хроматоном N-AW-DMCS (0,125 - 0,160 мм) с неподвижной фазой
SE-30 (5%). Линейность детектирования 0,1 - 3,0 нг
(0,0001 - 0,003 мкг). Время удерживания этилового эфира 2,4-Д - 1,6 - 2,2 мин.;
бутилового эфира 2,4-Д - 3,8 - 4,2 мин. В качестве альтернативной фазы
используют фазу XE-60 (5%). Однако эта фаза неоптимальна,
так как нижний предел обнаружения составляет 0,2 - 0,3 нг.
Эта фаза используется для качественного доказательства идентичности пиков.
Бутиловый эфир
2,4-Д, используемый в качестве гербицида и находящийся в пробе почвы, не
переходит в эфирный, а затем в гексановый экстракты в
процессе обработки пробы почвы.
Обработка результатов анализа. При наличии линейного диапазона детектирования (пропорциональной
зависимости изменения высоты пика от изменения концентрации раствора)
количественное определение 2,4-Д проводят методом соотношения со стандартом (градуировочным раствором) по высоте пика по формуле; при
отсутствии линейности детектирования, т.е. пропорциональности, - с помощью
графика зависимости концентрация - высота пика или метода соотношения со
стандартом, учитывая поправочный множитель, определяемый ежедневно:
CH V (1,4)
пр
X = -----------,
H P
ст
где:
X - содержание пестицида, мг/кг, мкг/г;
C - концентрация градуировочного
раствора 2,4-Д, мкг/мл;
H и
H - высота пика соответственно на хроматограмме градуировочного
ст пр
раствора и
почвенного экстракта из исследуемой пробы, мм;
V - объем гексанового
экстракта эфира 2,4-Д, из которого взята аликвота
для хроматографирования, мл;
P - масса навески почвы в
воздушно-сухом состоянии, г (в нашем случае -
20 г);
1,4 - поправочный множитель (коэффициент
пересчета), учитывающий потери
эфира 2,4-Д
в случае очистки
гексанового
экстракта эфира 2,4-Д
из
почвенного экстракта
серной кислотой без таковой
очистки градуировочного
раствора.
Использование в расчетной формуле C
(мкг/мл) правомочно в том случае, когда аликвоты градуировочного раствора и почвенного экстракта одинаковы
(в нашем случае они равны 4 мкл).
Требования безопасности. Соблюдаются требования безопасности, обычно рекомендуемые при
работе в химических лабораториях с легковоспламеняющимися и горючими жидкостями
(диэтиловый эфир и ацетон; гексан,
этиловый и бутиловый спирты), агрессивными веществами (кислоты, щелочи), сжатым
газом (баллон с азотом) и электрооборудованием (хроматограф, центрифуга,
встряхивающее устройство, весы, электроплитка, ротационный испаритель).