Утверждена
Начальником Управления
по внедрению новых
лекарственных средств
и медицинской техники
Э.А.БАБАЯНОМ
27 ноября 1985 года
МЕТОДИКА
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ВЫТЯЖЕК ИЗ МАТЕРИАЛОВ
И ИЗДЕЛИЙ НА ПОЛОВЫХ КЛЕТКАХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
В связи со все
увеличивающимся объемом разработок новых материалов и изделий особое значение
приобретает разработка экспресс-методов на биологических тест-объектах и
тест-системах. Эти методы можно применять в следующих
случаях: а) при отборе оптимальных лабораторных образцов материалов и изделий
на первом этапе их разработки; б) при оценке различных технологий переработки
материалов в изделие; в) при выборе оптимального способа стерилизации изделия;
г) при незначительном изменении рецептуры материала; д) при изменении сферы
применения хорошо изученного материала.
1. ПРИНЦИП МЕТОДИКИ
Визуально под микроскопом наблюдают
двигательную активность сперматозоидов быка, подвергавшихся воздействию водных
экстрактов из полимерных материалов, до полного прекращения
прямолинейно-поступательного движения.
2. ТЕСТ-ОБЪЕКТ
В качестве биологического тест-объекта экспресс-метода используется замороженная в
парах жидкого азота гранулированная сперма быка. Сперму замораживают в виде
гранул весом 0,1 - 0,2 г. При низкотемпературной консервации обменные процессы
в сперме полностью приостанавливаются. Замороженную сперму можно получать на
станциях искусственного осеменения или в Республиканском банке семени
Госагропрома СССР.
3. ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ
3.1. Приготовление
опытной и контрольной проб
Для определения степени токсичности
вытяжку необходимо сравнивать с контрольным раствором. Контрольной пробой
служит глюкозо-цитратная среда (состав среды: глюкоза
- 4 г, цитрат натрия - 0,58 г, вода дистиллированная
до 100 мл). Опытным образцом является водный экстракт из полимерного материала
или изделие, приготовленное в соответствии с научно-методическими документами
для данного вида изделий. Изотонию достигают путем добавления сухих реактивов
глюкозы (4 г) и цитрата натрия (0,58 г) на 100 мл вытяжки.
3.2. Приготовление
пробы спермы
Перед оттаиванием замороженной спермы
отмеривают пипеткой в пробирку 0,5 мл контрольной пробы. Четыре пробирки с глюкозо-цитратной средой ставят в водяную баню при
температуре +40 °C. Охлажденным до температуры жидкого азота длинным
анатомическим пинцетом извлекают из сосуда Дьюара
гранулу спермы и быстро опускают в нагретый раствор. В одной пробирке оттаивают
только одну гранулу спермы. Сразу после оттаивания содержимое пробирок сливают
в одну колбочку и тщательно перемешивают (маточный раствор).
3.3. Ход
определения
Из маточного раствора оттаянной
разбавленной спермы добавляют 0,3 мл суспензии сперматозоидов в 1 мл опытного
образца. Аналогично поступают и с контрольной пробой. Конечная концентрация
сперматозоидов в образцах - 6 - 7 млн/мл. Все пробирки
с опытными и контрольными растворами должны быть помещены в водяную баню при
температуре + 40 °C в течение всего эксперимента.
3.4. Оценка
результатов
Главным критерием оценки функционального
состояния сперматозоидов принимается длительность их движения. Оценка
подвижности производится микроскопированием капли
спермы из опытных и контрольных проб каждые 10 - 15 минут. Предметный столик
микроскопа должен быть постоянно нагрет до температуры +40 °C. Время
подвижности сперматозоидов определяется как среднее между двумя последними
измерениями, из которых первое определение регистрирует наличие хотя бы одной -
двух поступательно-подвижных клеток, а второе - полное прекращение
поступательного движения.
Степень токсичности испытуемого раствора
определяется отношением величин времени подвижности сперматозоидов в опыте и
контроле:
опыт
Т = ------ x 100,
контр.
где:
Т - степень токсичности;
опыт - время подвижности сперматозоидов в
испытуемом растворе;
контр. - время подвижности сперматозоидов в контрольном растворе.
Результаты опытов обрабатываются
статистическим методом парных сравнений по Стьюденту.