Утверждены

Минздравом СССР

27 сентября 1978 г. N 1917-78

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ТЕРБАЦИЛА В ПРОДУКТАХ

РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ВИНЕ, ВИНОГРАДНОМ СОКЕ,

ПОЧВЕ, ВОДЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

 

    Краткая характеристика  препарата.  Тербацил - 3-трет-бутил-5-

хлор-6-метилурацил. Брутто-формула C H  ClN O . Молекулярная масса

                                    9 13   2 2

216,7.  Химически  чистое  действующее   вещество   -   бесцветные

кристаллы.  Т.  пл.  175  -  177 °C,  давление   пара  0,0625  МПа

(29,5  °C).  Растворимость  в  воде  710 мг/кг   (25  °C).  Хорошо

растворим  в   диметилформамиде,   циклогексаноне,  умеренно  -  в

ксилоле.  ДСД 0,01 <*>, МДУ  0,01 <*> (яблоки, груши), 0,05  мг/кг

(виноград).

--------------------------------

<*> Временный норматив.

 

Принцип метода. Метод основан на извлечении тербацила из пробы водным раствором гидроксида натрия, экстракции органическим растворителем из подкисленного раствора, очистке перераспределением в системах двух несмешивающихся жидкостей и хроматографировании на колонке с оксидом алюминия с последующим определением методом ГЖХ или ТСХ.

При анализе вина, виноградного сока, виноградной лозы метод основан на экстракции препарата смесью спирт - ацетон (1:3), очистке окрашенных растворов смесью активированного угля с оксидом алюминия с последующим определением методом ТСХ.

Метрологическая характеристика метода. Пределы обнаружения методом ГЖХ - 3 нг, что составляет: в воде - 0,002 - 0,005; почве - 0,03; яблоках, грушах - 0,02; лимонах - 0,1 мг/кг или мг/л.

Доверительный интервал среднего определения: в воде - 89 +/- 5,6; почве - 78,5 +/- 6,1; растительном материале - 80,5 +/- 6,5%.

Пределы обнаружения методом ТСХ 2 - 5 мкг, что составляет: в воде - 0,01; почве - 0,1 - 0,15; в яблоках, грушах - 0,1; огурцах - 0,05; цитрусовых - 0,5; в вине, виноградном соке - 0,05; виноградной лозе, ее листьях, корнях, побегах - 0,1 - 0,2 мг/кг или мг/л.

Доверительный интервал среднего определения: в воде - 87 +/- 10, почве - 74 +/- 7, растительном материале - 70 +/- 9%.

Реактивы и растворы. Ацетон х.ч. Гексан х.ч. Хлороформ х.ч. Этиловый спирт-ректиф. Гидроксид натрия, 0,05 н и 1-процентные водные растворы. Серная кислота х.ч., 10 н раствор. Хлороводородная кислота. Сульфат натрия безводный х.ч. о-Толидин ч.д.а. Иодид калия х.ч. Марганцовокислый калий х.ч. Кислота уксусная ледяная х.ч. Крахмал водорастворимый ч.д.а. Силикагель КСК. Пластинки "Силуфол". Оксид алюминия 2-й степени активности для хроматографии. Сульфат кальция х.ч. Азот особой чистоты газообразный. Неподвижная фаза 5% SE-30 на хромосорбе W-DMCS (80 - 100 меш). Стекловата. Универсальная индикаторная бумага. Реактив для обнаружения тербацила N 1: 0,16 г о-толидина растворяют в 30 мл ледяной уксусной кислоты и доводят дистиллированной водой до 500 мл, после чего прибавляют 1 г иодида калия. Реактив для обнаружения тербацила N 2: 50 мл 1-процентного водного раствора иодида калия смешивают с 50 мл свежеприготовленного 3-процентного раствора крахмала (раствор крахмала при приготовлении прокипятить). Прибавляют 20 мл этилового спирта. Реактив применять только свежеприготовленным.

Получение газообразного хлора: смешивают в эксикаторе 1,5-процентный раствор марганцовокислого калия и 10-процентный раствор соляной кислоты в равных объемах.

Стандартные растворы тербацила готовят в спирте - 200 мкг/мл; ацетоне - 100 и гексане - 1,5 и 10 мкг/мл.

Приборы и посуда. Газожидкостный хроматограф с ДЭЗ (например, "Цвет-106"). Хроматографическая колонка стеклянная длиной 1 м и внутренним диаметром 3 мм. Микрошприц. Ротационный вакуумный испаритель. Аппарат для встряхивания. Водяная баня. Вакуумный водоструйный насос. Делительные воронки различной вместимости. Колбы: грушевидные или круглодонные на шлифах; конические; Бунзена. Воронки с пористыми фильтрами N 1 и 2 (шоттовские фильтры). Камера хроматографическая. Стеклянные пластинки размером 9 x 12 см. Сито капроновое 100 меш. Пульверизатор стеклянный. Камера для хлорирования (эксикатор или сосуд с внутренним диаметром 250 - 300 мм). Ступки фарфоровые. Ртутная кварцевая лампа. Сита металлические с диаметром отверстий 2 - 3 мм. Шкаф сушильный. Колонка стеклянная для распределительной хроматографии высотой 20 см и внутренним диаметром 18 - 20 мм.

Подготовка к определению. Приготовление хроматографических пластинок:

40 г силикагеля КСК (100 меш), 1 г водорастворимого крахмала и 125 мл дистиллированной воды. Крахмал заваривают в небольшом количестве воды (20 - 30 мл), доливают остальную воду, засыпают силикагель и хорошо перемешивают. Массу наносят равномерно на 15 пластинок;

оксид алюминия (50 г) и 5 г сульфата кальция (оба компонента просеивают через сито 150 меш) и 75 мл воды.

    Ход анализа. Экстракция. Пробу яблок,  груш,  винограда (50 г)

измельчают,  помещают  в  коническую  колбу  на 250 мл с притертой

пробкой  и дважды экстрагируют препарат 0,05 н NaOH порциями по 80

мл на аппарате для встряхивания в течение 5 мин. Экстракты сливают

в делительную воронку, промывая пробу 2 раза по 20 мл 0,05 н NaOH.

К экстракту приливают 3 - 5 раз по 70 мл н-гексана, встряхивают по

2 мин. и гексан отбрасывают. Затем к экстракту прибавляют  7 мл 10

н H SO  (pH 1 -  2),  перемешивают  и препарат трижды экстрагируют

   2  4

хлороформом  порциями по 75 мл, встряхивая по 2 - 3 мин. Экстракты

объединяют,   сушат   безводным  сульфатом  натрия,  количественно

фильтруют  и  отгоняют  растворитель на ротационном испарителе при

температуре 45 - 50 °C.

    К  сухому  остатку  в  колбочку  прибавляют  30  мл   гексана,

перемешивают 2 - 3 мин. и переносят в делительную воронку на 100 -

150 мл.  После  этого  колбу  промывают  2  раза 1-процентным NaOH

порциями  по  25  мл,  переносят  в  ту  же  делительную  воронку,

энергично  встряхивают 2 мин. и щелочной слой отделяют в колбочку,

а  гексан  сливают  в  другую  делительную воронку. Затем щелочной

экстракт  снова переносят в делительную воронку и дважды промывают

его  гексаном  порциями по 30 мл, а потом 2 раза хлороформом по 30

мл,  встряхивая  по  1  -  2  мин.  Промывные жидкости объединяют,

приливают к ним 20 мл 1-процентного NaOH, осторожно перемешивают 1

- 2 мин.  и  после  разделения  фаз  щелочной  слой присоединяют к

очищенному  экстракту,  а  смесь   растворителей   отбрасывают.  К

экстракту   прибавляют   3,5   мл  10  н  H SO ,   перемешивают  и

                                           2  4

экстрагируют тербацил трехкратным встряхиванием с 50 мл хлороформа

в  течение  2 - 3 мин.  Экстракты объединяют, сушат  над сульфатом

натрия  и  растворитель  отгоняют  до  объема  0,5 - 1 мл. Остаток

количественно  переносят  на  колонку  с оксидом алюминия. Колонку

готовят,  засыпая  15 г  оксида  алюминия  II  степени активности,

сульфат  натрия  безводный  на 2 см, и промывают 30 мл хлороформа.

Гербицид элюируют  хлороформом, отбрасывая первые 20 мл и  собирая

35 - 40 мл  элюата.  Элюат  упаривают  на  ротационном  испарителе

досуха. Для ТСХ добавляют 0,2 - 0,5 мл хлороформа, для ГЖХ - 1 - 3

мл гексана.

Пробу лимонов (10 - 15 г) [1] измельчают и дважды экстрагируют хлороформом порциями по 50 мл на аппарате для встряхивания в течение 30 мин. Объединенный хлороформный экстракт осушают над сульфатом натрия безводным и упаривают досуха на ротационном испарителе. Сухой остаток растворяют в 30 мл гексана, фильтруют через бумажный фильтр, а остаток обрабатывают еще 20 мл гексана, который также отфильтровывают. Объединенный гексановый экстракт обрабатывают 50 мл 1-процентного раствора NaOH. Далее поступают так, как описано выше.

Из воздушно-сухой почвы (30 - 50 г) [1], предварительно просеянной через сито с диаметром отверстий 2 - 3 мм, препарат дважды экстрагируют 0,05 н раствором NaOH порциями по 70 мл на аппарате для встряхивания в течение 5 мин. Экстракты фильтруют через воронку Бюхнера (диаметром 10 - 12 см) под вакуумом. Осадок на воронке промывают 50 мл раствора едкого натра, экстракт переносят в делительную воронку и экстрагируют 3 - 5 раз гексаном порциями по 70 мл. Дальнейший ход анализа аналогичен вышеописанному.

Пробу воды (200 - 500 мл) [1] помещают в воронку, подкисляют 10 н серной кислотой до pH 1 - 2 и препарат экстрагируют хлороформом трижды порциями по 75 мл хлороформа в течение 3 - 5 мин. Растворитель объединяют, сушат над безводным сульфатом натрия и отгоняют в условиях, указанных выше.

Измельченную пробу мандаринов, апельсинов (50 г без кожуры) [2] заливают хлороформом и в течение 1 ч экстрагируют на аппарате для встряхивания. Растворитель отфильтровывают, остаток промывают трижды хлороформом по 20 мл. Весь хлороформенный экстракт пропускают через колонку с оксидом алюминия, предварительно промытую 15 мл хлороформа. Диаметр колонки 19 - 20 мм, высота слоя сорбента 75 мм. После элюирования всего хлороформенного экстракта колонку промывают 25 мл хлороформа и весь элюат концентрируют до 0,1 мл.

Навеску чистых вымытых огурцов (50 г) [2] измельчают, подкисляют 10 н серной кислотой до pH 2 - 3, заливают хлороформом и 1 ч встряхивают. Экстракт фильтруют через безводный сульфат натрия, пробу трижды промывают 20 мл хлороформа. Объединенный экстракт помещают в колбу прибора для отгонки растворителя и отгоняют до 0,1 мл.

Экстракцию почвы, зеленых листьев, виноградной лозы (побеги и корни) [3] проводят следующим образом. Навеску воздушно-сухой, просеянной через сито с диаметром отверстий 1 - 2 мм почвы (100 г) заливают смесью спирта с ацетоном (1:3) до покрытия пробы и оставляют на ночь в колбе с притертой пробкой или экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 2 ч. Полученный раствор отфильтровывают под вакуумом. Остаток в колбе и на фильтре трижды промывают небольшими порциями растворителя. Общий экстракт упаривают до небольшого объема и хроматографируют. Сильно окрашенные растворы обесцвечивают путем добавления активированного угля (5 г) или смеси его с окисью алюминия (5 г угля и 7 - 8 г окиси алюминия).

Навеску листьев (10 г), корней или побегов (20 г) растирают с кварцевым песком и безводным сульфатом натрия, заливают той же смесью спирта с ацетоном и обрабатывают аналогично пробам почвы. После добавления сорбента вытяжку для лучшего ее обесцвечивания выдерживают 30 мин. на водяной бане при 30 - 40 °C, затем перемешивают на аппарате для встряхивания в течение 1 ч или оставляют на ночь. После этого раствор высушивают сульфатом натрия, упаривают и хроматографируют.

Вино, виноградный сок, воду (100 мл анализируемой пробы) [3] помещают в колбу прибора для отгонки растворителя под вакуумом и упаривают досуха. К сухому остатку прибавляют 10 - 15 мл охлажденной смеси этанол - ацетон (1:3). Встряхивают и фильтруют через воронку с фильтром, заполненную сульфатом натрия безводным. Операцию повторяют еще дважды. Объединенный спиртово-ацетоновый раствор упаривают до объема 0,1 мл и хроматографируют.

Газожидкостная хроматография. Используется для количественного определения содержания тербацила в пробах, обозначенных знаком [1].

    Условия хроматографирования. Хроматограф с ДЭЗ.  Рабочая шкала

                    -12

электрометра 20 x 10    А.  Скорость  движения ленты самописца 240

мм/ч.  Колонка  стеклянная размером 1 м x 3 мм. Неподвижная фаза -

5% SE-30  на  хромосорбе  W-DMCS  (80 - 100 меш). Температура, °C:

термостата  колонок  -  190;  детекторов  - 210; испарителя - 220.

Расход газов (азот особой чистоты) - 40; на поддувку - 120 мл/мин.

Объем   пробы,  вводимой  в   хроматограф,   2 - 6  мкл.  Линейный

динамический   диапазон   3  -  25  нг.  Минимально  детектируемое

количество 3 нг. Время удерживания 1,65 мин.

    Тонкослойная  хроматография.  Используется  для количественной

оценки содержания тербацила в пробах,  обозначенных  знаками [2] и

[1] (можно использовать гексановый экстракт после ГЖХ).

    На  пластинку  с  силикагелем  наносят  пробы   и  стандартные

растворы   тербацила   и  хроматографируют   в   системе  гексан -

этилацетат (3:2). После хроматографирования пластинку оставляют на

воздухе до полного удаления запаха растворителей  и  помещают  под

ртутно-кварцевую  лампу  на расстоянии 18 - 20 см на 15 мин. Затем

пластинку  помещают  в  камеру  для  хлорирования  на  2  - 5 мин.

(работать  под  тягой!)  и после улетучивания хлора с проветренной

пластинки опрыскивают раствором о-толидина (реактив N 1). При этом

на  светлом  фоне  проявляются  темно-синие  пятна  тербацила с R

                                                                 f

0,55 +/- 0,05.

    При использовании системы хлороформ - ацетон (3:1)  в качестве

альтернативной величина R  тербацила 0,67 +/- 0,05.

                         f

    Экстракты проб, обозначенные  знаком [2], хроматографируют  на

пластинках с оксидом алюминия или пластинках "Силуфол". В качестве

подвижной  фазы  используют  смеси  гексан  - хлороформ - уксусная

кислота  (6:7:3)  или  гексан - ацетон - уксусная кислота (6:7:3).

После  хроматографирования  и  высушивания  на  воздухе  пластинки

помещают  в  камеру с газообразным хлором на 3 - 5 мин. Через 30 -

40 мин. пластинку опрыскивают йод-крахмальным реагентом (реактив N

2).  Величина  R  тербацила  на  оксиде  алюминия  0,57  - 0,6, на

                f

пластинках  "Силуфол" - 0,4 - 0,45 и 0,6 - 0,65 соответственно для

указанных выше систем.

    Обработка  результатов  анализа. Газожидкостная хроматография.

Содержание  препарата  в пробе (X, мг/кг или мг/л) рассчитывают по

методу абсолютной калибровки по формуле:

 

                           100 H   V

                                пр  1

                       X = ----------,

                             K V  P

                                2

 

    где:

    H   - высота пика препарата в пробе, мм;

     пр

    V  - объем анализируемой пробы, мл;

     1

    V  - объем хроматографируемой пробы, мкл;

     2

    P - навеска или объем, г или мл;

    K - калибровочный коэффициент, мм/нг, определяется по формуле:

 

                           H     H     H

                        1   1     2     3

                    K = - (--- + --- + ---),

                        3  CV    CV    CV

                             1     2     3

 

    где:

    C   -   концентрация   стандартного   раствора,   вводимого  в

хроматограф, мкг/мл (нг/мкл);

    V , V , V  - объемы стандартного раствора, мкл;

     1   2   3

    H , H , H  - высоты пиков препарата, мм.

     1   2   3

Тонкослойная хроматография. Количество препарата определяют путем сравнения размера пятен и интенсивности их окраски проб и стандартных растворов. Содержание препарата в пробе (X, мг/кг или мг/л) вычисляют по формуле:

 

                               100A

                           X = ----,

                                P

 

где:

A - количество препарата, найденное путем визуального сравнения со стандартом, мкг;

P - навеска или объем, г или мл.