Утверждены
Министерством здравоохранения СССР
29 июля 1991 г. N 6193-91
ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ТИТУСА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ
И ЗЕРНЕ КУКУРУЗЫ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ
ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ
Настоящие Методические указания
предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и
научно-исследовательских учреждений Минздрава РФ, а также ветеринарных,
агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза РФ и
лабораторий других ведомств, занимающихся определением остаточных количеств
пестицидов, регуляторов роста растений и биопрепаратов в продуктах питания,
кормах и внешней среде.
Методические указания апробированы и
рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госхимкомиссии
по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками.
1. Краткое описание
препарата
Химическое название:
1-(4,6-диметоксипиримидин-2-ил)-3-[(3-этилсульфонилпиридин-2-ил)сульфонил]мочевина.
OCH
___N N___/ 3
// \\---SO NH-C-NH--// \\
\ ___ / 2 \\
\ ___ /
--- \ O
N --- \
SO C H OCH
2 2 5 3
Общепринятые названия: титус,
ДРХ-Е9636.
Эмпирическая формула: C H N O
S .
14 17 5 7 2
Молекулярная масса: 431,4.
Химически чистый
титус представляет собой белое кристаллическое
вещество с температурой плавления 176 - 178 °C. В виде сухой пленки на стекле и
в растворе в ацетонитриле относительно устойчив; в кислой (pH < 3) и
щелочной среде (pH > 9) быстро гидролизуется.
Период полураспада в водной среде при pH 5 - 4,6 дня;
pH 7 - 7,2 дня; pH 9 - 0,3
дня, в почве - от 1,7 до 4,3 дня.
Хорошо растворим в ацетонитриле,
метиленхлориде и хлороформе. Растворимость в
дистиллированной воде: при 25 °C < 10 мг/л, в буферном растворе при pH 7 - 7,3 г/л.
Титус малотоксичен
для человека и теплокровных животных (СД
50
для крыс
> 5000 мг/кг), не
обладает побочными токсическими
эффектами, может
вызвать слабое раздражение слизистой оболочки
глаз.
Титус - новый повсходовый гербицид, эффективный в
борьбе со злаковыми однолетними и многолетними сорняками в посевах кукурузы и
посадках картофеля. Зарегистрирован в России как средство борьбы со злаковыми
сорняками, особенно гумаем ползучим, в посевах
кукурузы в виде 75-процентной сухой текучей суспензии с нормой расхода 40 - 50
г/га.
2. Методика
определения титуса в зеленой массе и зерне
кукурузы методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии
2.1. Основные
положения
2.1.1. Принцип метода
Методика основана на определении остатков
титуса с помощью высокоэффективной жидкостной
хроматографии с использованием фотокондуктивного
детектора и колонки с силикагелем. Определение проводят после экстракции
гербицида буферной смесью и реэкстракции метиленхлоридом.
Количественное определение проводится
методом абсолютной калибровки.
2.1.2. Избирательность метода
В предлагаемых условиях метод специфичен
в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании кукурузы: 2,4-Д, симазин, атразин, эрадикан.
2.1.3. Метрологическая характеристика
метода
Таблица 1
┌─────────────┬───┬────────────────────────────────────────────────────────────┐
│Анализируемый│ n │ Метрологические параметры, P =
0,95 │
│
объект │ ├───────┬─────────────┬────────────┬─────────────┬───────────┤
│
│ │предел │ диапазон
│ среднее │ стандартное │доверитель-│
│
│ │обнару-│определяемых
│ значение │отклонение S,│ный │
│
│ │жения, │концентраций,│определения,│ %
│интервал │
│
│ │мг/кг │
мг/кг │ % │ │среднего │
│
│ │ │ │ │ │результата,│
│
│ │ │ │ │ │% │
├─────────────┼───┼───────┼─────────────┼────────────┼─────────────┼───────────┤
│Зеленая масса│ │
│ │ │ │ │
│растений
│15 │0,05 │0,05
- 1,0 │89,0 │7,48 │+/- 4,1 │
│Зерно
│ │ │ │ │ │ │
│кукурузы
│15 │0,05 │0,05
- 1,0 │86,5 │6,40 │+/- 3,5 │
└─────────────┴───┴───────┴─────────────┴────────────┴─────────────┴───────────┘
2.2. Реактивы и
материалы
Титус с содержанием действующего вещества 99,5% фирмы Дюпон.
Ацетонитрил, ТУ 6-09-3534-82.
Вода бидистиллят,
ГОСТ 7602-72.
Калий фосфорнокислый двузамещенный.
Кислота уксусная ледяная, ГОСТ 61-75.
Кислота ортофосфорная, ГОСТ 6552-80.
Метилен хлористый для хроматографии, ГОСТ
12794-80.
Натрий сернокислый безводный, хч, ГОСТ 4166-76.
Спирт изопропиловый, ГОСТ 9805-84.
Спирт метиловый для хроматографии, ТУ
6-09-1709-77.
Циклогексан для хроматографии, ТУ
6-09-1832-77.
Приготовление растворов:
а)
1 - молярный
раствор K HPO : 174
г фосфорнокислого
2 4
двузамещенного
калия помещают в
мерную колбу объемом 1000 мл,
добавляют дистиллированной воды
до полного растворения соли и
доводят объем
водой до метки;
б)
фосфатный буфер (pH 7,0): смешивают 150 мл 1 М K HPO с
2 4
1350 мл
дистиллированной воды. Доводят pH смеси до
7,0, добавляя
по каплям
концентрированную ортофосфорную кислоту и контролируя pH
среды с помощью универсального иономера;
в) экстрагирующая смесь: готовят смесь
метанола с фосфатным буфером в соотношении 75:25 по объему;
г) подвижная фаза для ВЭЖХ: циклогексан -
750 мл, изопропанол - 125 мл, метанол - 125 мл, смесь
уксусной кислоты с водой (9:1) - 1 мл;
д) состав для кондиционирования колонки: изопропанол - 400 мл, уксусная кислота ледяная - 100 мл,
вода бидистиллят - 10 мл.
Приборы, аппаратура, посуда
Жидкостный хроматограф "Уотерс", модель 510, с фотокондуктивным
детектором "Тракор", модель 965, или другой
аналогичного типа.
Колонка стальная длиной 30 см с сорбентом
на основе силикагеля с удельной поверхностью 300 кв. м/г и размером частиц 10
мкм марки мю-Порасил фирмы Уотерс
или Силасорб-300 фирмы Хемапол.
Мельница лабораторная.
Гомогенизатор лабораторный со стаканом
емкостью 100 - 150 мл.
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М,
ТУ 25-11-917-74, или аналогичного типа.
Водоструйный насос, ГОСТ 25336-82.
Иономер универсальный ЭВ-74.
Воронки конические, стеклянные, ГОСТ
25336-82.
Воронки делительные на 500 мл, ГОСТ
25336-82.
Концентраторы грушевидные КТУ-100-14/19
НШ-19, ГОСТ 25336-82.
Воронки Бюхнера
фарфоровые диаметром 70 мм, ГОСТ 9147-80.
Колбы Бунзена объемом 800 мл, ГОСТ
25336-82.
Пипетки мерные на 2,0; 1,0; 5,0; 10,0; 25
мл, ГОСТ 20292-74.
Колбы мерные на 25, 50 и 100 мл, ГОСТ
1770-74.
Вата стеклянная для хроматографии.
Фильтры диаметром 20 мм с отверстиями 20
мкм фирмы Милипор.
2.3. Отбор проб
Отбор проб проводится в соответствии с
"Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции,
пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).
Отобранные пробы зерна подсушивают до стандартной влажности и хранят в сухом,
хорошо вентилируемом помещении. Перед анализом пробы размалывают на
лабораторной мельнице до размеров частиц менее 1 мм.
Пробы зеленой массы замораживают и хранят
в холодильнике при температуре ниже -15 °C.
2.4. Подготовка к
определению
2.4.1. Кондиционирование хроматографической колонки
Перед началом работы хроматографа раствор
для кондиционирования колонки и подвижную фазу дегазируют в течение 2-х часов,
пропуская через растворы гелий. Операцию повторяют ежедневно в течение 1 часа
перед началом анализа, не выключал прибора. При добавлении новой порции
растворителей дегазирование проводят в течение 2-х
часов.
Готовую колонку устанавливают в термостат
хроматографа и стабилизируют при 35 °C, пропуская через нее в течение 4-х часов
раствор для кондиционирования колонки со скоростью 0,5 мл и затем еще 4 часа
подвижную фазу для ВЭЖХ с той же скоростью. Эту операцию проводят ежедневно
перед началом ввода проб в ночное время с использованием таймеров (реле
времени). Нарушение данного режима приводит к резкой потере чувствительности.
2.4.2. Приготовление стандартных
растворов
Стандартный раствор N 1 с концентрацией титуса 1 мг/мл готовят следующим образом: взвешивают 50 мг титуса с точностью +/- 0,0002 г, переносят навеску в мерную
колбу на 50 мл ацетонитрилом и доводят объем раствора
до метки этим же растворителем. Методом последовательного разбавления в ацетонитриле готовят стандартный раствор N 2 с
концентрацией 100 мкг/мл. Растворы N 1 и 2 можно хранить в холодильнике не
более 1 месяца.
Для калибровки хроматографа ежедневно
готовят рабочие стандартные растворы с концентрацией титуса
0,1; 0,2; 0,4; 0,6 мкг/мл, внося пипеткой соответствующее количество раствора N
2 в мерные колбы, упаривая ацетонитрил досуха током
азота и доводя объем раствора до метки подвижной фазой без уксусной кислоты.
Хроматографируют по 20 мкл каждого рабочего раствора,
измеряют высоту пика (или площадь) и строят график зависимости высоты (площади)
пика от концентрации титуса.
2.5. Описание
определения
2.5.1. Экстракция и очистка экстракта
Навеску измельченного зерна или зеленой
массы - 10 г помещают в пластиковую банку с крышкой, приливают 100 мл
экстрагирующей смеси и гомогенизируют в течение 1 мин. при скорости 1500 об./мин. Банки с гомогенатом
устанавливают на встряхиватель, закрывают плотно
крышками и встряхивают 10 мин. По истечении срока банки переносят в центрифугу
с охлаждением и центрифугируют 10 мин. при скорости 3500 - 4500 об./мин. Экстракт осторожно переносят
в воронку Бюхнера с бумажным фильтром и фильтруют под
вакуумом в колбу Бунзена. Экстракцию повторяют, добавляя в банку 50 мл ацетонитрила, встряхивая 10 мин., центрифугируя и
отфильтровывая. Объединенный экстракт переносят из колбы Бунзена в чистую
пластиковую банку объемом 250 мл, обмывая колбу экстрагирующей смесью. К
экстракту приливают 50 мл метиленхлорида, банку
плотно закрывают крышкой и интенсивно встряхивают смесь в течение 10 мин. Затем
экстракт центрифугируют 10 мин. при 3500 - 4500 об./мин. Содержимое банки осторожно (по стеклянной палочке)
переносят в делительную воронку и нижний слой (метиленхлорид)
сливают в концентратор через безводный сульфат натрия. Повторяют экстракцию еще
2 раза порциями метиленхлорида по 50 мл с последующим
центрифугированием. Объединенные экстракты упаривают досуха на ротационном
испарителе при t = 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 5 мл подвижной
фазы, не содержащей уксусной кислоты, и вводят в хроматограф 20 мкл раствора.
2.5.2. Условия хроматографирования
Жидкостный хроматограф "Уотерс", модель 510, с программатором температуры и фотокондуктивным детектором "Трактор", модель
365.
Показания аттенуатора
- 1 x 50.
Скорость движения ленты самописца - 120
мм/час.
Колонка стальная длиной 30 см, внутренний
диаметр 3 мм. Неподвижная фаза - мю-Порасил, Уотерс.
Температура колонки - 35 °C.
Скорость потока подвижной фазы - 0,3
мл/мин.
Объем пробы, вводимой в колонку, - 20 мкл.
Абсолютное время удерживания титуса - 27 мин. 29 сек.
Линейность детектирования сохраняется в
пределах 2 - 20 нг.
Каждую анализируемую пробу вводят 2 раза
и вычисляют среднюю высоту (площадь) пика. Образцы, дающие пики большие, чем
стандартный раствор 1,0 мкг/мл, разбавляют.
2.5.3. Обработка результатов анализов
Содержание титуса
рассчитывают методом соотношения со стандартом по формуле:
П
x A x V
пр
X = -----------,
П x p
с
где:
X - содержание гербицидов в пробе, мг/кг;
П - высота (площадь) пика стандарта, мм;
с
П - высота (площадь) пика образца, мл;
пр
A - концентрация стандартного раствора,
мкг/мл;
V - объем
экстракта, подготовленного для хроматографирования,
мл;
p - масса анализируемого образца, г.
3. Требования
техники безопасности
Необходимо соблюдать общепринятые правила
безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами,
электронагревательными приборами и сжатыми газами.
Таблица 2
ПОЛНОТА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИТУСА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ И
ЗЕРНЕ КУКУРУЗЫ
(5 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ)
┌────────────────┬─────────────────┬─────────────────┬────────────────────┐
│ Среда
│Добавлено титуса,│Обнаружено, мг/кг│Полнота определения,│
│ │ мг/кг
│ │ % │
├────────────────┼─────────────────┼─────────────────┼────────────────────┤
│Зеленая
масса │0,5 │0,469 │93,8 │
│ │0,1 │0,00833 │83,3 │
│ │0,05 │0,045 │90,0 │
│Зерно
кукурузы │0,5 │0,418 │83,5 │
│ │0,1 │0,0859 │85,9 │
│ │0,05 │0,045 │90,0 │
└────────────────┴─────────────────┴─────────────────┴────────────────────┘