Утверждаю
Начальник Главного управления
эпидемиологии и гигиены
Р.И.ХАЛИТОВ
27 ноября 1990 года
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРОБ С ИМИТАТОРАМИ БИОЛОГИЧЕСКИХ
ПОРАЖАЮЩИХ АГЕНТОВ (БПА)
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Настоящие Методические рекомендации
содержат сведения, направленные на упрощение и унификацию методик по
приготовлению проб с имитаторами биологических поражающих агентов. Рекомендации служат дополнением к вышедшим в 1987 году
"Методическим указаниям по подготовке и применению имитаторов
биологических агентов с целью проверки готовности учреждений санэпидслужбы к
работе по специфической индикации и лабораторному контролю", утвержденным
МЗ СССР 02.04.86.
Рекомендации подготовлены Республиканской
санэпидстанцией Минздрава РСФСР (Э.Ф. Опочинский, О.С. Палей, З.А. Лукина);
раздел приготовления проб с риккетсиями подготовлен Омским
научно-исследовательским институтом природно-очаговых инфекций (к.м.н. Рудаков
Н.В.).
Методические рекомендации предназначены
для учебных занятий и учений по специфической индикации и лабораторному
контролю в учреждениях здравоохранения, входящих в СНЛК.
Все пробы или большинство из них должны
содержать кроме биологических агентов в качестве "фонового"
загрязнения постороннюю бактериальную флору. Исключение составляют пробы,
имитирующие незагрязненные или мало загрязненные биологические субстраты
(кровь, пунктаты бубонов) или объекты внешней среды (водопроводная вода).
"Фоном" может служить смыв с различных объектов внешней среды, свободных
от антимикробных, моющих средств или горюче-смазочных материалов. Его получают
путем ополаскивания тампона в физрастворе до получения значительной мутности. В
пробы объемом 5, 10 и 15 мл добавляют соответственно 2, 4 и 6 капель этого
смыва. Более надежным является приготовление суспензии из суточного газона
непатогенных штаммов стафилококка, водных вибрионов, иерсиний, бац. цереус, кишечной палочки
(например, штамма М-17 из колибактерина) и других микроорганизмов. Взвесь
готовят по стандарту мутности ГИСК 10 ед. или предпочтительнее 5 ед., что дает
более четкие результаты. Соответствующее стандартам содержание некоторых
микроорганизмов показано в таблице 1.
Таблица 1
ПРИМЕРНОЕ СОДЕРЖАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В МЛРД.
МИКРОБНЫХ
КЛЕТОК В 1 МЛ. В СООТВЕТСТВИИ СО СТАНДАРТОМ
МУТНОСТИ
┌─────┬────────────────────────────────────────────────┬───────────────────────┐
│N п/п│ Микроорганизмы │Стандарт мутности в ед.│
│ │
├───────────┬───────────┤
│ │
│ 5 │
10 │
├─────┼────────────────────────────────────────────────┼───────────┼───────────┤
│1 │Возбудитель
холеры │1,0 │2,0 │
│2 │Возбудитель
чумы │0,5 │1,0 │
│3 │Возбудитель
сибирской язвы (вегетативная форма) │0,05 │0,1 │
│4 │То же (споры) │0,5 │1,0 │
│5 │Возбудитель
бруцеллеза │0,8 │1,6 │
│6 │Возбудитель
туляремии │2,5 │5,0 │
│7 │Риккетсии
Провачека │0,65 │1,3 │
│8 │Коксиеллы
Бернета │3,3 │6,6 │
│9 │Кишечная
палочка │0,5 │1,0 │
│10 │Стафилококк │0,5 │1,0 │
│11 │Б.
Цереус (вегетативная форма) │0,05 │0,1 │
└─────┴────────────────────────────────────────────────┴───────────┴───────────┘
Имитаторы бактериальных агентов -
вакцинные штаммы бактерий могут быть использованы после или без
предварительного культивирования. В первом случае применяют односуточную
культуру штамма СТИ сибиреязвенного микроба, двухсуточную - штамма ЕУ чумного
микроба, выращенного при температуре 37°. Методика приготовления суспензий
аналогична описанной выше. При использовании коммерческих
вакцин необходимо иметь в виду, что штаммы туляремийного и бруцеллезного
микроба хорошо выявляются после регидратации вакцины методами ФА и РНГА и хуже
при культивировании вследствие замедленного роста на питательных средах, а
штамм ЕУ следует добавлять в пробы в концентрациях, в 10 - 100 раз больших по
сравнению с культивированным вариантом, так как в РПГА и МФА выявляются не
все микробные клетки. Качество приготовленных проб рекомендуются проверить
обоими методами.
Для получения взвесей из коммерческих
вакцин затруднительно пользоваться стандартом мутности из-за цветовых различий
разведенного препарата и стандарта. Удобнее принять математические расчеты
концентрации клеток в ампуле. В наставлении к вакцинам указано содержание
бактерий в одной прививочной дозе, а на коробке - число доз в ампуле. Вакцина
ЕУ содержит в одной подкожной дозе 300 млн. (в
накожной - 3 млрд.) микробных клеток.
Если ампула содержит, например, 214 доз
(X = 214), то это соответствует наличию в ней: X x 300 млн. = 64,2 млрд. м.к.
При разведении содержимого ампулы в одном миллилитре жидкости получится взвесь
64,2 млрд. м.к./мл, а при дальнейшем ее разведении в 64 раза (0,1 мл суспензии
и 6,3 мл физраствора) - 1 млрд. м.к./мл. Такую суспензию удобно разводить до
нужной концентрации. С этой целью содержимое ампулы с вакциной-имитатором БПА разводят как описано выше в 1 мл жидкости и к 0,1 мл
полученной взвеси добавляют физраствор по расчетам, приведенным в таблице 2, в
которой X - количество прививочных доз в ампуле.
КОЛИЧЕСТВО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА,
НЕОБХОДИМОГО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СУСПЕНЗИЙ
МИКРОБНЫХ КЛЕТОК
ТРЕБУЕМОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ
┌───────────────────┬────────────┬─────────────────────────┬───────────────────┐
│
Вакцина │
Концентр. │ Количество │ Получаемая │
│ │ м.к.
│физиологического раствора│
концентрация │
│ │ в 1 дозе │ │суспензии в
м.к./мл│
├───────────────────┼────────────┼─────────────────────────┼───────────────────┤
│Чумная (подкожная) │300 млн. │0,03 x X - 0,1 │1 млрд. │
│Чумная (накожная) │3 млрд. │0,3 x X - 0,1 │1 млрд. │
│Бруцеллезная │13,3 млрд. │1,33 x X - 0,1 │1 млрд. │
│Сибиреязвенная │400 млн. │0,4 x X - 0,1 │100 млн. │
│Туляремийная │200 млн. │0,2 x X - 0,1 │100 млн. │
└───────────────────┴────────────┴─────────────────────────┴───────────────────┘
Пользуясь формулой в приведенном выше примере,
для вакцины ЕУ получаем аналогичные результаты: 0,03 x 214 - 0,1 = 6,3 (мл ф.р.
на 0,1 мл суспензии вакцины).
Убитая холерная вакцина Эль-Тор содержит
в ампуле 80 или 160 млрд. м.к., и для получения взвеси в 1 млрд. м.к./мл
содержимое ампулы растворяют соответственно в 1 или 2 мл и к 0,1 мл полученной
суспензии дополнительно прибавляют 7,9 мл физраствора.
Все ампулы после разведения выдерживают
до полного растворения и тщательно перемешивают. Хлопья сибиреязвенной вакцины
можно разбить путем неоднократного интенсивного
пипетирования жидкости пипеткой с тонко оттянутым концом. Процедура выполняется
с соблюдением мер предосторожности для исключения разбрызгивания материала.
Имитаторы
бактериальных агентов удобно вносить в пробы из исходных концентраций от 1
млрд. м.к./мл до 100 тыс. м.к./мл, а микробный "фон" - от 10 тыс. до
100 тыс. м.к./мл. Это обеспечивает
содержание последнего в пробе от 500 до 2 тыс. клеток в 1 мл, а при посеве на
плотные среды - рост от единичных до 100 - 200 колоний.
В таблице 3 показано количество
суспензии, которое нужно добавить из исходной концентрации в пробы объемами 5;
10; 15 и 20 мл, чтобы получить взвесь с необходимым числом клеток.
Предпочтительным является внесение мерного количества суспензии, однако не
исключается добавление материала каплями, близкими по объему к 0,025 мл (в 1 мл
от 35 до 45 капель). При пользовании таблицей необходимо иметь в виду, что
пробы, приготовленные в небольших объемах (5 или 10 мл), в ходе индикации могут
быть разведены до 20 мл, то есть в 4 или 2 раза, что соответственно снижает
концентрацию клеток. В таких случаях для ее сохранения вносят микробную взвесь
из расчета окончательного объема пробы.
Таблица 3
┌──────────────────────┬─────────────┬─────────────┬─────────────┬─────────────┐
│
Концентрация │ Проба 5
мл │ Проба 10 мл │ Проба 15
мл │ Проба 20 мл │
│ м.к.
в 1 мл │ │ │ │ │
├───────────┬──────────┼─────┬───────┼─────┬───────┼─────┬───────┼─────┬───────┤
│
исходн. │ нужная │мерно│каплями│мерно│каплями│мерно│каплями│мерно│каплями│
├───────────┼──────────┼─────┼───────┼─────┼───────┼─────┼───────┼─────┼───────┤
│1 млрд.
│100 млн. │0,5 │-
│1,0 │- │1,5 │-
│2,0 │- │
│
│10 млн. │0,05 │2 │0,1 │4
│0,15 │6 │0,2 │8
│
│
│5 млн. │0,025│1 │0,05 │2 │0,075│3 │0,1 │4
│
│
│2 млн. │- │- │0,02 │1 │0,03 │1 │0,05 │2 │
├───────────┼──────────┼─────┼───────┼─────┼───────┼─────┼───────┼─────┼───────┤
│500 млн.
│10 млн. │0,1 │4
│0,2 │8 │0,3 │12
│0,4 │- │
│
│5 млн. │0,05 │2 │0,1 │4
│0,15 │6 │0,2 │8
│
│
│2 млн. │0,02 │1 │0,04 │2 │0,06 │2 │0,08 │3 │
│
│1 млн. │- │- │0,02 │1 │0,03 │1 │0,05 │2 │
├───────────┼──────────┼─────┼───────┼─────┼───────┼─────┼───────┼─────┼───────┤
│100 млн.
│10 млн. │0,5 │-
│1,0 │- │1,5 │-
│2,0 │- │
│
│5 млн. │0,25 │10 │0,5
│- │0,75 │- │1,0 │-
│
│
│2 млн. │0,1 │4
│0,2 │8 │0,3 │12
│0,4 │- │
│
│1 млн. │0,05 │2 │0,1 │4
│0,15 │6 │0,2 │8
│
│
│500 тыс. │0,025│1 │0,05 │2 │0,075│3 │0,1 │4
│
├───────────┼──────────┼─────┼───────┼─────┼───────┼─────┼───────┼─────┼───────┤
│50 млн.
│5 млн. │0,5 │-
│1,0 │- │1,5 │-
│2,0 │- │
│ │2 млн. │0,2
│8 │0,4 │-
│0,6 │- │0,8 │-
│
│
│1 млн. │0,1 │4
│0,2 │8 │0,3 │12
│0,4 │- │
│
│500 тыс. │0,05 │2 │0,1 │4
│0,15 │6 │0,2 │8
│
│
│250 тыс. │0,025│1 │0,05 │2 │0,075│3 │0,1 │4
│
├───────────┼──────────┼─────┼───────┼─────┼───────┼─────┼───────┼─────┼───────┤
│10 млн.
│1 млн. │0,5 │-
│1,0 │- │1,5 │-
│2,0 │- │
│
│500 тыс. │0,25 │10 │0,5
│- │0,75 │- │1,0 │-
│
│
│250 тыс. │0,12 │5 │0,25 │10 │0,38 │- │0,5 │-
│
│
│100 тыс. │0,05 │2 │0,1 │4
│0,15 │6 │0,2 │8
│
├───────────┼──────────┼─────┼───────┼─────┼───────┼─────┼───────┼─────┼───────┤
│100 тыс.
│2 тыс. │0,1 │4
│0,2 │8 │0,3 │12
│0,4 │- │
│
│1 тыс. │0,05 │2 │0,1 │4
│0,15 │6 │0,2 │8
│
│
│500 м.к. │0,025│1 │0,05 │2 │0,075│3 │0,1 │4
│
├───────────┼──────────┼─────┼───────┼─────┼───────┼─────┼───────┼─────┼───────┤
│10 тыс.
│2 тыс. │1,0 │-
│2,0 │- │3,0 │-
│4,0 │- │
│
│1 тыс. │0,5 │-
│1,0 │- │1,5 │-
│2,0 │- │
│
│500 м.к. │0,25 │10 │0,5
│- │0,75 │- │1,0 │-
│
└───────────┴──────────┴─────┴───────┴─────┴───────┴─────┴───────┴─────┴───────┘
Объем чемеричной воды, вносимой в пробу,
из-за нестандартности препарата устанавливается для каждой серии
экспериментально. Чтобы получить наглядную клиническую картину и гибель
животного, требуется увеличение концентрации чемеричной воды по сравнению с
дозой, предлагаемой "Методическими указаниями...", иногда в 5 - 10
раз (1 объем имитатора на 8 - 10 объемов пробы); животным вводят не менее 0,5
мл этого материала.
Содержимое
ампулы с вирусом осповакцины растворяют из
расчета
0
1 мл физраствора на каждые 10 доз, получая цельную (10 )суспензию,
6
в которой одна доза
содержит около 10
ООЕ - оспообразующих
-1 -2
единиц. Из нее
готовят дополнительные разведения 10 и
10 и из
нужного
разведения вносят 0,05 мл (2 капли) на каждые 5 мл пробы.
В таблице 4
представлены ожидаемые результаты культивирования
вируса на чувствительных клетках HEP-2, YER0, RK-13 и
других при
инокуляции вируса в различных концентрациях.
Таблица 4
┌────────────────┬─────────────────┬───────────────────────────────────────────┐
│ Исходная │Содержание
вируса│ Ожидаемый
эффект │
│
суспензия │ в пробе
│ │
├───────┬────────┼───────┬─────────┤ │
│разве- │кол. ООЕ│разве- │кол. ООЕ │ │
│дение │
в 1 мл │дение │ в 1 мл │ │
├───────┼────────┼───────┼─────────┼───────────────────────────────────────────┤
│ 0 │
7 │ -2 │ 5 │ │
│10 │10 │10 │10 │Заражение большого числа клеток в первые │
│ │ │ │ │сутки │
│ -1 │
6 │ -3 │ 4 │ │
│10 │10 │10 │10 │Гнездное заражение клеток за 30 -
40 часов │
│ -2 │
5 │ -4 │ 3 │ │
│10 │10 │10 │10 │Заражение отдельных клеток
позднее 40 часов│
└───────┴────────┴───────┴─────────┴───────────────────────────────────────────┘
Эффект заражения должен быть
предварительно проверен, так как он зависит от серии вакцины, условий ее
хранения, чувствительности клеток. При его снижении дозу инокулята увеличивают.
Для приготовления проб с риккетсиями
необходимо иметь следующие диагностические препараты:
1. Растворимые антигены Провачека или
Музера для РСК или антиген Провачека для реакции гемагглютинации.
2. Корпускулярный антиген Провачека для
РА.
3. Корпускулярный антиген Бернета для
РСК.
4. Вакцина против лихорадки Ку живая.
5. Вакцина сыпнотифозная комбинированная
живая.
6. Гамма-глобулин к риккетсиям Провачека
из комплекта для выявления риккетсий сыпного тифа или сыворотка из комплекта
для РСК с антигеном Провачека.
Растворимые антигены хорошо выявляются в
РНГА, корпускулярные - в МФА. Вакцины могут быть использованы для проверки
знаний по ускоренной индикации, режиму работы с риккетсиями и дезинфекции. При
работе с ними необходимо строгое соблюдение противоэпидемического режима и 3 -
4-кратный пассаж штаммов на куриных эмбрионах с соблюдением стерильности.
Интенсивность роста контролируют микроскопией стенок желточного мешка при
окраске по Здродовскому или МФА.
Замедленный рост риккетсий обычно не
позволяет провести накопление вакцинных штаммов до 24 - 48 часов исследования.
Поэтому чаще используются перечисленные выше компоненты 1 - 3 и 6.
Антиген для РСК разводят согласно
указанию на ампуле. Объем антигена, вносимый в пробу, определяется эмпирически
с предварительным добавлением разных количеств препарата.
Обычным является добавление 1/3 или 1/4 содержимого ампулы на 20 мл пробы. Нехватка антигена приводит к отрицательной РПГА, избыток - к
увеличению расходования сыворотки для РТПГА или к появлению агглютината в лунке
с РТПГА, если сыворотки внесено недостаточно.
Корпускулярный антиген также разводят в
соответствии с указанием на ампуле. Полученную суспензию тщательно пипетируют
шприцом с тонкой иглой или пипеткой, титруют и приготовляют мазки на стекле
(антигенные пятна). Мазки окрашивают по Здродовскому или люминесцирующей
сывороткой. Оптимальной считается концентрация в 100 - 150 корпускул в поле
зрения для учебных занятий и 5 - 10 корпускул для проверки готовности к
индикации. Выбранное оптимальное разведение увеличивают в 5 - 20 раз с учетом
объема пробы. В пробу целесообразно вносить одновременно и растворимый, и
корпускулярный антиген.
Для приготовления значительного
количества проб разными концентрациями микробных агентов рекомендуется
составить программу подготовки каждой отдельной пробы. Сведения по
приготовлению проб вносят в протокол, подписанный врачом и лаборантом. Форма
протокола может быть произвольной. Ниже указаны вариант формы протокола и
примеры по его заполнению для проб объемом в 15 мл.
┌─────┬─────────────────────────────────────────┬────────────┬─────────────────┐
│Номер│ Компоненты пробы │ Количество │ Расчетная │
│пробы│ │ (в мл)
│концентрация м.к.│
│ п/п │ │ │ в 1 мл пробы
│
├─────┼─────────────────────────────────────────┼────────────┼─────────────────┤
│1 │Вакцина
ЕУ 100 млн. м.к./мл │0,15 │1 млн. │
│ │Стафилококк
10 тыс. м.к./мл │0,75 │500 м.к. │
│ │Чемеричная
вода (нативная) │1,5 │- │
│ │Физиологический
раствор │12,6 │ │
│ │ │ │ │
│2 │Туляремийная
вакцина 100 млн. м.к./мл │0,75 │5 млн. м.к. │
│ │Кишечная
палочка 100 тыс. м.к./мл │0,15 │1 тыс. м.к. │
│ │Физиологический
раствор │14,1 │
│
└─────┴─────────────────────────────────────────┴────────────┴─────────────────┘
и так далее для каждой пробы.
Затем составляется программа
внесения микроорганизмов и
токсина. Например: ЕУ из 100 млн. м.к./мл в пробы N: 1;
6 и 14;
ЕУ 1 капля из 100 млн. м.к./мл в N: 3 и 15;
Э. коли из 10 тыс. м.к./мл в N: 2; 4; 5 и 12, и
т.д. для
каждого микроорганизма и для каждого
вносимого объема
исходной суспензии.
Перечень имитаторов, включенный в
упомянутые выше "Методические указания...", не является строго
обязательным и может быть расширен в зависимости от целей и задач учения.
Расширение рецептуры требует использования всего арсенала коммерческих препаратов
для обнаружения микроорганизмов, включая люминесцирующие сыворотки к шигеллам,
брюшнотифозному микробу и другим возбудителям, или некоммерческих
диагностических препаратов (выдаются посредником). При условии проведения
головными учреждениями индикации классическими методами может быть поставлена
задача по выделению и идентификации различных микроорганизмов, входящих в
рецептуру. В этом случае целесообразно составлять ее из определенного набора
агентов без использования неизвестного "фонового" загрязнения.
Необходимо отметить, что взвеси,
приготовленные из сухих препаратов, таких как антигены Провачека и Бернета,
вакцины ЕУ, СТИ и другие, необходимо выдерживать от момента растворения до
добавления в пробу не менее 3 - 6 часов в жидкой фазе для набухания клеток, что
улучшает результаты люминесцентной микроскопии.
Следует иметь в виду, что в пробах,
содержащих живые микроорганизмы, при хранении и транспортировке может
происходить частичное отмирание клеток, зависящее от влияния
"фоновой" среды или других, не всегда предсказуемых факторов, что
приводит в ряде случаев к появлению ложных отрицательных результатов. Из этого
вытекает необходимость контроля качества проб, который может осуществляться
путем непосредственного наблюдения за ходом исследования. При отсутствии такой
возможности следует оставлять часть каждой пробы или готовить дубликаты проб.
Их начинают исследовать экспрессными методами и культивировать примерно в одно
время с наиболее удаленной из проверяемых лабораторий. Результаты контроля
фиксируются в журнале. Полученные в процессе индикации результаты целесообразно
сопоставлять не только со сведениями, находящимися у посредника (они отражают
состояние проб в момент приготовления), но и с контрольными результатами, что
особенно важно при наличии расхождений в результатах исследований.