Утверждены
Минздравом СССР
8 июня 1989 г. N 5019-89
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГЛИНА (ХЛОРСУЛЬФУРОНА) В ПОЧВЕ,
ВОДЕ И РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ
ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА <*>
--------------------------------
<*> Разработаны
А.В. Чигриным, А.М. Умновым, Д.И. Чканиковым
(ВНИИФ).
Краткая характеристика препарата дана в
Методических указаниях N 5018-89.
Принцип метода. Метод основан на
экстракции хлорсульфурона из почвы 70-процентным
этанолом, из воды и водного гомогената растительного
материала - метиленхлоридом, переводе остатка после
упаривания экстракта в фосфатно-солевой буфер (pH
7,2) с последующим определением препарата иммуноферментным методом. Сущность
последнего заключается в проведении высокоспецифичной иммунохимической реакции,
основанной на конкуренции между свободным гербицидом, находящимся в
анализируемом образце, и адсорбированным на твердой фазе белковым конъюгатом хлорсульфурона за
центры связывания антител, меченных пероксидазой,
полученных против данного гербицида. Количественное определение заключается в
измерении оптической плотности растворов, содержащих окрашенный продукт
ферментной реакции, с помощью спектрофотометра (длина волны 492 нм), с последующей математической обработкой.
Избирательность метода. Метод селективен. Другие гербициды из класса сульфонилмочевин,
симм-триазинов и мочевин, а также продукты разрушения
хлорсульфурона в почве определению не мешают.
Метрологическая характеристика метода. Нижний предел определения хлорсульфурона
в воде 0,05 мкг/л; среднее значение определения 97,2 +/- 5,7%; доверительный
интервал среднего (p = 0,95, n = 5) +/- 7,1%. Нижний предел определения хлорсульфурона в почве 0,2 мкг/кг; среднее значение
определения 98,8 +/- 5,4%; доверительный интервал среднего (p = 0,95, n = 8)
+/- 4%. Нижний предел определения хлорсульфурона в
растениях 0,5 мкг/кг; среднее значение определения 98,7 +/- 7,3%;
доверительный интервал среднего (p = 0,95, n = 10) +/- 5,2%.
Реактивы
и растворы. Иммуноферментный набор
(белковый конъюгат
хлорсульфурона и
меченные пероксидазой антитела против гербицида).
Этиловый
спирт. н-Гексан х.ч. Метиленхлорид х.ч. Карбонат натрия
безводный х.ч.
Гидрокарбонат натрия
х.ч. Натрий фосфорнокислый двузамещенный,
12-водный,
х.ч. Фосфорнокислый натрий однозамещенный, 2-водный, ч.д.а. Хлорид натрия
х.ч. Пероксид
водорода х.ч. Серная
кислота, 1 н раствор,
х.ч.
Хлороводородная кислота,
2 н раствор, х.ч. Лимонная
кислота, х.ч.
о-Фенилендиамин.
Альбумин сывороточный бычий.
Твин-20 (Ferrak). Растворы:
0,02 М
фосфатно-солевой буфер (pH 7,2),
содержащий 0,1% твина-20.
Растворяют 11,61
г Na HPO x 12H
O, 1,18 г NaH PO
x 2H O, 8,77 г NaCl, 1 г
2 4 2 2
4 2
твина-20 в
1 л дистиллированной воды; 0,05 М
карбонатный буфер (pH 9,6).
Растворяют 0,42
г Na CO , 0,72
г NaHCO в 250
мл дистиллированной воды;
2 3 3
0,2 М
цитратно-фосфатный буфер (pH 5,4). Растворяют 3,99 г Na HPO x 12H O,
2 3 2
0,93 г C H
O x H O в 100 мл бидистиллированной
воды; стандартный раствор
6 8 7 2
хлорсульфурона
в 0,05 М
карбонатном буфере (pH 9,6), 1 мг/мл.
Рабочие
растворы: раствор белкового конъюгата хлорсульфурона в
карбонатном буфере.
Растворяют 15 мкл конъюгата в 20 мл
карбонатного буфера; раствор меченных
ферментом антител.
Растворяют 10 мкл антител
в 5 мл фосфатно-солевого
буфера с
добавлением 1% бычьего альбумина.
Приборы и посуда. Планшеты полистироловые московского завода "Медполимер",
обработанные согласно технологии, разработанной авторами. Спектрофотометр
"Sumal-PE" (ГДР) или аналогичный прибор для
ИФА. Дозатор "Sumal-DS" (ГДР). Дозаторы
проб РДО-5, РДО-20. Дозаторы реактивов RDO (50; 100 мкл)
(ГДР). Термостат. Механический встряхиватель.
Роторный испаритель. Центрифуга рефрижераторная. Колбы: конические плоскодонные
на 50 и 100 мл; мерные на 50; 100; 250; 1000 и 2000 мл; грушевидные с
нормальным шлифом на 10; 25; 50 и 100 мл. Пробирки
градуированные на 10 мл. Воронки: фильтровальные стеклянные; делительные
стеклянные вместимостью 50; 100 и 250 мл. Гомогенизатор. Пипетки мерные на 0,1;
1; 2; 5 и 10 мл. Цилиндры мерные вместимостью 25; 50 и 100 мл. Стаканы
стеклянные на 50; 100 и 150 мл. Фильтры бумажные "синяя лента".
Секундомер. Весы технические. Весы аналитические. Насос водоструйный
лабораторный стеклянный или любой другой. Универсальная индикаторная бумага.
Сито (размер отверстий 1 мм).
Подготовка образцов для иммуноферментного
анализа. Проверка пригодности реактивов для ИФА. При получении новой партии
реактивов необходимо провести "холостой" опыт для проверки
пригодности реактивов для ИФА. Если процент мигрирования
иммунной реакции будет меньше 10%, реактивы считаются пригодными для
дальнейшего использования. В случае превышения данного уровня необходимо
провести очистку способами, рекомендованными для конкретного реактива.
Экстракция. В коническую колбу помещают 10
г воздушно-сухой почвы, просеянной через сито. Ее заливают 20 мл 70-процентного
этанола и экстрагируют в течение 30 мин. при постоянном встряхивании. Затем
экстракт сливают в центрифужную пробирку, а почву
вновь экстрагируют 20 мл 70-процентного этанола 30 мин. По окончании экстракции
экстракты объединяют и центрифугируют в течение 5 мин. Из полученного объема
экстракта отбирают 10 мл и упаривают до водного остатка объемом не более 1 мл.
Объем водного остатка доводят до 10 мл 0,02 М фосфатно-солевым буфером (pH 7,2), содержащим 0,1% Твин-20 (ФСБТ), фильтруют и
анализируют.
Пробу воды (30 мл) подкисляют до pH 3, помещают в делительную воронку на 100 мл и трижды
экстрагируют равным объемом метиленхлорида, добиваясь
полного разделения фаз. Органическую фракцию упаривают до объема 5 - 10 мл и
переносят в грушевидную колбу вместимостью 50 мл, после чего упаривают досуха.
Остаток растворяют в 30 мл ФСБТ при постоянном встряхивании в течение 30 мин.
Экстракт фильтруют и анализируют.
Пробу зеленых растений льна или пшеницы
(5 г) гомогенизируют с 50 мл 96-процентного этанола, инкубируют 15 - 20 мин.
при 20 °C. Сухие образцы (солома, створки коробочек, семена пшеницы или льна)
разрушают в жидком азоте в гомогенизаторе, после чего дважды экстрагируют
5-кратным объемом 96-процентного этанола по 30 мин. К
полученным гомогенатам добавляют дистиллированную
воду в количестве, равном 1/10 объема экстрагента, и
центрифугируют в течение 20 мин. при 15 - 20 °C. Супернатант
осторожно сливают в грушевидную колбу и упаривают до водного остатка объемом не
более 0,3 - 0,5 мл. Водный остаток доводят дистиллированной водой до исходного
объема и центрифугируют в течение 30 мин. Супернатант
осторожно сливают в делительную воронку и трижды экстрагируют 0,3 - 0,5 мл гексана, добиваясь полного разделения фаз. Гексан отбрасывают, а водную фракцию подкисляют 2 н
раствором хлороводородной кислоты до pH 3 и трижды экстрагируют 0,3 - 0,5 мл метиленхлорида.
Дальнейший этап аналогичен анализу водного образца.
Ход анализа. Белковый конъюгат
(15 мкл) хлорсульфурона
(антиген) растворяют в 20 мл 0,05 М карбонатного буфера (pH
9,6). Полученный раствор с помощью дозатора "Sumal-DS"
переносят в лунки 96-луночного полистиролового
планшета (по 200 мкл в каждую лунку). Планшет
инкубируют в течение 2 ч при 37 °C. Затем планшет опорожняют и трижды промывают
дистиллированной водой, а потом трижды промывают ФСБТ, инкубируя планшет в
течение 5 мин. с буфером после каждой промывки. Из стандартного раствора хлорсульфурона (1 мг/мл) путем серийных разведений готовят
4 раствора хлорсульфурона в ФСБТ концентрациями 50;
100; 200 и 400 кг/мл. Анализируемый раствор и хлорсульфурон
в четырех известных концентрациях добавляют в лунки планшета, освобожденного от
промывочного буфера, по 50 мкл в каждую лунку. В 2 контрольных ряда вместо указанных растворов вносят по 50 мкл чистого ФСБТ. Все операции проводят с помощью
дозатора. К подготовленному планшету добавляют рабочий раствор антител,
меченных пероксидазой, приготовленный непосредственно
перед использованием, по 50 мкл с помощью дозатора в
каждую лунку. При этом происходит конкуренция свободного гербицида в
анализируемом образце и адсорбированном на стенках лунок белковым
конъюгатом хлорсульфурона
за центры связывания антител. Через 1 ч планшеты вновь промывают дистиллированной
водой и ФСБТ (3 раза по 5 мин.). Затем проводят ферментативную реакцию. Для
этого 4 мг о-фенилендиамина растворяют в 10 мл 0,2 М
цитратно-фосфатного буфера (pH 5,4), добавляют 20 мкл пероксида водорода и с помощью дозатора добавляют в
лунки планшета (по 100 мкл в лунку). При этом
пероксид водорода расщепляется под действием пероксидазы,
происходит выделение кислорода и окисление им о-фенилендиамина
с изменением окраски буфера. Через 20 мин. реакцию останавливают путем
добавления 1 н серной кислоты с помощью дозатора по 100 мкл
в каждую лунку. Оптическую плотность раствора продукта ферментной реакции
определяют на спектрофотометре "Sumal-PE"
при длине волны 492 нм.
Обработка результатов анализа.
Количественно хлорсульфурон (X, пкг/мл)
определяют по одной из двух формул:
Y/55,4
2
X = K x 10 ; (1)
Y/55,4
2
X = K x 20 , (2)
где:
K - поправочный коэффициент;
Y - процент ингибирования иммунной реакции:
ОПК - ОПО
Y = 100 ---------,
ОПК
где:
ОПК - оптическая плотность контрольных
рядов (среднее из 16 определений);
ОПО - оптическая плотность опытного ряда
(среднее из 8 определений).
Выбор формулы зависит от коэффициента
сорбции для каждого планшета. Коэффициент K определяют при подсчете результатов
анализа известных концентраций хлорсульфурона. Он
постоянен для конкретного планшета.
Пример расчета содержания хлорсульфурона в пробе. Чтобы вычислить поправочный
коэффициент K, измеряют оптическую плотность растворов контрольного ряда
планшета и ряда стандартов. Например, оптическая плотность растворов
контрольного ряда (среднее из 16 определений) равна 1,25. Оптические плотности
стандартных растворов равны: 50 пкг/мл - 1,09; 100 пкг/мл - 0,89; 200 пкг/мл - 0,69;
400 пкг/мл - 0,52. Вычисляют процент ингибирования
иммунной реакции Y другими стандартами препаратов. Например, для концентрации
50 пкг/мл он будет равен:
1,25 - 1,09 x 100
Y = ----------------- = 12,7%.
1,25
Аналогично вычисляют процент
ингибирования иммунной реакции для других концентраций стандартов (табл. 105) и
вычисляют коэффициент по формуле:
X
K = ---------.
Y/55,4
2
10
Таблица 105
ПРИМЕР РАСЧЕТА ПОПРАВОЧНОГО КОЭФФИЦИЕНТА K
┌───────────────────────┬──────────────────────┬─────────────────┐
│ Стандарт, пкг/мл │
Ингибирование │ K
│
├───────────────────────┼──────────────────────┼─────────────────┤
│50 │12,7 │3,4 │
│100 │28,8 │3,7 │
│200 │44,7 │3,6 │
│400 │58,6 │3,4 │
│ │Среднее │3,5 │
└───────────────────────┴──────────────────────┴─────────────────┘
Далее определяют процент ингибирования
иммунной реакции анализируемыми образцами и по формуле (1), в которой
коэффициент K равен 3,5, рассчитывают концентрацию препарата в растворе в пкг/мл. Полученное значение умножают на 4, если анализируют
почвенный образец, поскольку 1 г почвы экстрагируется 4 мл растворителя, или на
10, если анализируется растительный образец. При этом получают количество хлорсульфурона в пкг/г или мл
анализируемого субстрата. Коэффициент K варьирует (пкг/г
или пкг/мл) в зависимости от планшета, поэтому
калибровка каждого планшета обязательна. В пределах одного планшета коэффициент
K постоянен.
Требования безопасности. Необходимо
соблюдать правила работы с пестицидами и химическими реактивами.