Утверждены
Минздравом СССР
8 июня 1989 г. N 5004-89
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА ПРЕПАРАТА ТОРК
И ЕГО МЕТАБОЛИТА В ВОДЕ, ПОЧВЕ И РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ
МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
--------------------------------
<*> Разработаны
В.Н. Кавецким, Л.И. Бублик, В.А. Лесовой
(УкрНИИЗР), Г.О. Оганесяном, Ю.А. Бунятяном
(Филиал ВНИИГИНТОКС).
Торк (оксид
фенбутатина) - акарицид. Действующее вещество
препарата -
ди[трис(2-диметил-2-фенилэтилового)олова]оксид. Брутто-формула C H OSn .
60 78 2
Молекулярная
масса 1052. Химически чистое вещество представляет собой белый
кристаллический порошок с т. пл. 138 - 139,5 °C, хорошо
растворимый в ряде
органических растворителей (ксилол, толуол, бензол, гексан, ацетон и др.),
практически не растворимый в воде, нелетуч. В воде гидролизуется с
образованием трис(2-метил-2-фенил)пропилоловогидроксида, который
при
комнатной
температуре переходит опять в исходное вещество. Разрушается под
действием сильных
окислителей. Препарат торк малотоксичен,
ЛД для белых
50
крыс 2500 мг/кг
(орально).
Принцип метода. Метод
основан на извлечении торка из воды, яблок хлористым
метиленом, хлороформом, петролейным эфиром или торка совместно с метаболитом из воды, яблок, цитрусовых,
огурцов смесью хлороформ-уксусная кислота (75:1), очистке экстрактов на колонках
с силикагелем КСК или оксидом алюминия и хроматографировании
в тонком слое с последующим обнаружением зон локализации соединений путем
обработки гематоксилином, пирокатехиновым фиолетовым, кверцетином,
дитизоном.
Метрологическая характеристика метода приведена
в таблице 47.
Таблица 47
МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА (p = 0,95,
n = 5)
┌─────────┬───────────┬────────┬───────┬────────┬──────────┬──────────────┐
│Пластинка│Анализируе-│Анализи-│Предел │Объем │Диапазон │
Среднее │
│ │мый
объект │руемое
│обнару-│(масса) │определяе-│ значение
│
│ │ │соеди- │жения, │анализи-│мых кон- │определения, %│
│ │ │нение │мкг
│руемой
│центраций │ │
│ │ │<*> │ │пробы, │мг/кг, │ │
│ │ │ │ │мл, г │мг/л │ │
├─────────┼───────────┼────────┼───────┼────────┼──────────┼──────────────┤
│"Силуфол"│Вода │Т │3 │50 │0,06 - 0,2│93,05 +/- 2,57│
│УФ │ │М │2,5 │50 │0,06 - 0,2│99,0 +/- 1,57 │
│ 254 │ │ │ │ │ │ │
│ │Яблоки, │Т │2 │50 │0,08 - 0,4│97,55 +/- 4,38│
│ │цитрусовые,│ │ │ │ │ │
│ │огурцы │М │3 │25 │0,12 - 0,4│91,0 +/- 2,96 │
│Силика- │Почва │Т │2,5 │50 │0,05 - 0,4│86,0 +/- 3,8 │
│гель │Яблоки │Т │10 │50 │0,2 - 0,4 │81,8 +/- 6,1 │
└─────────┴───────────┴────────┴───────┴────────┴──────────┴──────────────┘
--------------------------------
<*> Т - торк,
М - метаболит торка.
Избирательность метода. Определению не
мешают препараты акрекс, кельтан,
антио, рогор, применяемые,
как и торк, против растительноядных клещей.
Определению могут мешать оловоорганические препараты, например пликтран и его метаболиты.
Реактивы
и растворы. Ацетон х.ч. Уксусная кислота ледяная х.ч.
Гексан
х.ч. Хлороформ х.ч. Хлороводородная кислота ч.д.а., 0,2 н водный раствор.
Метилен хлористый
ч. Серная кислота
ч.д.а.,
0,2 н водный
раствор.
Петролейный
эфир (используется только
фракция с т. кип. 40 - 60 °C) ч.
Пирокатехиновый фиолетовый
(индикатор) ч.д.а., 0,1-процентный раствор в
этиловом спирте. Лимонная кислота х.ч., 0,5-процентный водный
раствор.
Гематоксилин х.ч., 0,1-процентный
раствор в этиловом
спирте. Кверцетин
х.ч.,
0,1-процентный раствор в
этиловом спирте. Вода
дистиллированная.
Натрия сульфат безводный ч.д.а. Углерод четыреххлористый ч.д.а. Дитизон
ч.д.а.,
0,01-процентный раствор в
четыреххлористом углероде. Анилин
хлороводородный ч.д.а.,
0,02-процентный водный раствор. Этиловый спирт х.ч.
Бумажные фильтры
обеззоленные ("синяя лента").
Силикагель КСК. Силикагель
Silpearl (Чехословакия) для тонкослойной
хроматографии. Хроматографические
пластинки "Силуфол" УФ .
Алюминия оксид для
хроматографии II степени
254
активности. Стандартные растворы торка
и его метаболита с содержанием 10 и
100 мкг в
1 мл смеси ацетон-уксусная кислота
(75:1), готовят из х.ч.
веществ.
Приборы и посуда. Весы технические типа
ВЛКТ. Весы аналитические типа ВЛДП. Аппарат для встряхивания жидкости в
лабораторной посуде. Испаритель ротационный ИР-1М или другого типа. Камера для хроматографирования. Пульверизатор стеклянный. Осветитель
ультрафиолетовый. Баня водяная. Плита электрическая. Колбы: мерные на 25 и 100
мл; конические ТС на 50; 100 и 250 мл; круглодонные на 100 мл. Цилиндры мерные
на 10; 20; 50; 100 и 250 мл. Воронки лабораторные. Стаканы химические ТС на 50
и 100 мл. Хроматографические колонки стеклянные
диаметром 1,5 см и длиной 30 см. Воронки делительные на 250 мл. Пипетки на 0,1;
1; 5; 15 и 20 мл. Ртутно-кварцевая лампа ПРК-2 или ПРК-4. Пластинки стеклянные
для хроматографии размером 9 х 12 см.
Подготовка к определению. Приготовление
растворов. Стандартные растворы торка и его
метаболита (100 мкг/мл). 25 мг х.ч. вещества помещают
в мерную колбу на 25 мл и растворяют смесью ацетон-уксусная
кислота (75:1). Отбирают 10 мл раствора в мерную колбу на 100 мл и доводят до
метки смесью ацетона с уксусной кислотой (75:1).
Стандартные растворы торка
и его метаболита (10 мкг/мл). Из стандартного раствора торка
и его метаболита (100 мкг/мл) отбирают 10 мл в мерную колбу на 100 мл и доводят
до метки смесью ацетона с уксусной кислотой (75:1). Растворы хранят в
прохладном защищенном от света месте не дольше 1 мес.
0,1-процентный раствор гематоксилина в
95-процентном этиловом спирте. 0,1 г гематоксилина помещают в колбу на 100 мл,
добавляют 1 каплю концентрированной хлороводородной
кислоты и доводят до метки 95-процентным этиловым спиртом. Раствор хранят в
темной склянке не дольше недели.
0,1-процентный раствор пирокатехинового
фиолетового. 0,1 г пирокатехинового фиолетового растворяют в 100 мл этилового
спирта. Раствор хранят в темной склянке не дольше недели.
0,1-процентный раствор кверцетина в 96-процентном этиловом спирте. Кверцетин (0,5 г) растворяют в 300 мл этилового спирта при
слабом нагревании, охлаждают, добавляют 25 мл концентрированной хлороводородной кислоты и доводят объем до 500 мл этиловым
спиртом. Раствор хранят в темной склянке не дольше недели.
0,01-процентный раствор дитизона в четыреххлористом углероде. Свежеприготовленный
0,01-процентный раствор дитизона в четыреххлористом
углероде с последующей обработкой 0,02-процентным раствором хлороводородного
анилина хранят в темном и прохладном месте, используя не дольше двух дней.
0,5-процентный раствор лимонной кислоты.
Лимонную кислоту (0,5 г) растворяют в 99,5 мл дистиллированной воды. Раствор
хранят не дольше 1 мес.
0,2 н раствор серной кислоты.
Концентрированную серную кислоту (5,56 мл) разбавляют водой до 1 л. Хранят в
сухом прохладном месте не дольше 3 мес.
Приготовление хроматографической
колонки с силикагелем. Стеклянную колонку размером 1,5 х 30 см, снабженную
краном и стеклянным фильтром, заполняют на 25 см силикагелем КСК (0,7 мм).
Колонку перед употреблением промывают смесью хлороформа с уксусной кислотой
(75:1).
Приготовление хроматографических
пластинок. 20 г силикагеля смешивают в стеклянном стаканчике с 29 мл 0,5 н
уксусной кислоты и перемешивают в течение 15 мин. стеклянной палочкой. Смесь
наносят на три стеклянные пластинки размером 9 х 12 см. Сушат на воздухе 14 -
15 ч. Пластинку "Силуфол" помещают в хроматографическую камеру с 0,5 н уксусной кислотой. После
того как растворитель поднимется до верхнего края, пластинку вынимают и сушат 1
ч на воздухе.
Приготовление колонки с оксидом алюминия.
Оксид алюминия II степени активности, нейтральный (100 г) помещают в коническую
колбу на 250 мл, добавляют 6 мл дистиллированной воды и перемешивают при
встряхивании в течение 7 ч.
В хроматографическую
колонку вкладывают ватный тампон, затем насыпают оксид алюминия слоем высотой 7
см и пропускают 20 - 25 мл растворителя (хлористый метилен, хлороформ).
Ход анализа. Экстракция, очистка экстрактов
и хроматографирование. Пробу воды (50 мл) переносят в
коническую колбу на 250 мл и заливают 15 мл смеси хлороформа с уксусной
кислотой (75:1) (для определения торка и его
метаболита) или 15 мл органического растворителя: хлороформ, хлористый метилен,
петролейный эфир (для определения торка).
Экстрагируют на встряхивателе в течение 5 - 10 мин.
Переносят смесь в делительную воронку и разделяют водный слой. Органическую
фракцию собирают в отдельную колбу вместимостью 50 мл. Водный слой еще трижды
экстрагируют тем же экстрагентом (порциями по 15 мл)
и снова собирают в ту же колбу. Объединенные экстракты фильтруют через фильтр с
безводным сульфатом натрия. Отгоняют растворитель на ротационном испарителе и
остаток наносят на хроматографическую пластинку, обработанную
уксусной кислотой. Рядом наносят стандартные растворы торка
и метаболита, содержащие 1 - 5 мкг соединений, и хроматографируют
в системе подвижных растворителей гексан-ацетон
(4:1). После того как растворители поднимутся на высоту 10 см, пластинку
вынимают, сушат на воздухе 30 мин. и проявляют хроматограмму.
Воздушно-сухую измельченную почву (50 г)
помещают в коническую колбу и заливают 100 мл органического растворителя.
Экстрагируют торк при встряхивании в течение 15 мин.
Затем экстракт отделяют и фильтруют через бумажный фильтр с безводным сульфатом
натрия. Экстракцию в течение 7 - 10 мин. повторяют еще дважды, заливая по 50 мл
растворителя. Объединенные экстракты упаривают на роторном испарителе до
небольшого объема (1 - 2 мл). Остаток наносят количественно полоской с левой
стороны на пластинку размером 9 х 12 см с силикагелем и хроматографируют
в подвижной фазе гексан-ацетон (4:1). Когда фронт
растворителей поднимется на высоту 10 см, пластинку вынимают, сушат на воздухе
30 мин., затем поворачивают пластинку против часовой стрелки на 90°, слева
наносят стандартный раствор, содержащий 1 - 5 мкг торка,
и хроматографируют в той же подвижной фазе. После
того как растворители поднимутся на высоту 10 см, пластинку вынимают, сушат на
воздухе 1 ч и проявляют хроматограмму.
Измельченный растительный материал
(яблок, цитрусовых, огурцов) (25 г) помещают в коническую колбу на 250 мл и
заливают 50 мл смеси органического растворителя с уксусной кислотой (75:1).
Экстрагируют на встряхивателе в течение 5 мин. Экстракт
отделяют, а растительный материал экстрагируют еще трижды порциями растворителя
по 15 - 20 мл. Объединенные экстракты пропускают через колонку с силикагелем
КСК, собирая элюат в колбу прибора для отгонки
растворителя и упарив до 1 - 2 мл, остаток наносят на хроматографическую
пластинку. Экстракты можно очищать также, предварительно упарив пробу до 1 - 2
мл, внеся остаток в подготовленную колонку с оксидом алюминия и промыв ее 50 мл
хлороформа. Элюат упаривают до 1 - 2 мл и наносят на хроматографическую пластинку. Рядом наносят стандартные
растворы торка и его метаболита, содержащие 1 - 5 мкг
соединений, и хроматографируют в подвижной фазе гексан-ацетон (4:1). После того как растворитель поднимется
на высоту 10 см, пластинку вынимают, сушат на воздухе 1 ч и проявляют хроматограмму одним из четырех способов: 1) опрыскивание 1
мл 0,1-процентного раствора гематоксилина в 95-процентном этиловом спирте, УФ-облучение в течение 5 мин. и опрыскивание 1 мл
0,5-процентного водного раствора лимонной кислоты; 2) УФ-облучение
в течение 10 мин. и опрыскивание 1 мл 0,1-процентного этанольного
раствора пирокатехинового фиолетового; 3) опрыскивание 1 мл 0,2 н раствора
серной кислоты, УФ-облучение в течение 10 мин. и опрыскивание 1 мл
0,1-процентного этанольного раствора кверцетина; 4) опрыскивание 1 - 2 мл 0,01-процентного
раствора дитизона в четыреххлористом углероде,
опрыскивание 0,02-процентным раствором (1 - 2 мл) хлороводородного
анилина.
При
наличии торка и
его метаболита в
пробе на хроматограмме,
обработанной
гематоксилином, зоны локализации соединений проявляются в виде
сиреневых пятен на голубом фоне; при обработке пирокатехиновым
фиолетовым
- в виде синих
пятен на светло-коричневом фоне; кверцетином - в виде
желтых
пятен на светлом
фоне; дитизоном - в виде желтых пятен на
бледно-розовом
фоне. Величины R торка и его метаболита равны соответственно 0,66 +/- 0,01
f
и 0,37
+/- 0,01. Содержание торка и его метаболита в пробе находят путем
сравнения размеров
и интенсивности окраски
пятен с пятнами стандартных
растворов.
Обработка
результатов анализа. Концентрацию торка
и его метаболита (X,
мг/л, мг/кг)
рассчитывают по формуле:
A
X = -,
P
где:
A - количество вещества, обнаруженное на хроматограмме, мкг;
P - объем (вода)
или навеска (почва, растительный материал) исследуемой пробы, взятой для
анализа, мл, г.
Требования безопасности. Следует
соблюдать все необходимые меры безопасности при работе в химических
лабораториях.