Утверждаю
Заместитель
Главного государственного
санитарного врача СССР
В.И.ЧИБУРАЕВ
8 июня 1989 г. N 4996-89
ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ БАСТА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ В ЯБЛОКАХ, БАНАНАХ,
СЕМЕНАХ РАПСА МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ
Краткая
характеристика препарата
1. Баста - DL-гомоаланин-4-ил-(метил)-фосфонат аммония (по
номенклатуре ИЮПАК)
O
│ - + C H N O P
(CH P-CH -CH -CH-COOH) NH 5 15 2 4
3││ 2 2 │ 4
O NH М.м. 198,19.
2
T
215 °C (разложение). Фирменное название: ХОЕ 039866.
пл.
2.
Метаболио-баста-3-метилфосфинат-пропионовая кислота (по номенклатуре ИЮПАК)
OH
│ C
H O P
CH P-CH -CH -COOH 4 9 4
3││ 2 2
O М.м.
152,1.
Фирменное название: ХОЕ 061517.
3. Продукт разложения
баста-DL-гомоаланин-4-ил(метил)-фосфиновая
кислота (по номенклатуре ИЮПАК)
OH
│ C
H NO P
CH P-CH -CH -CH-COOH 5 2 4
3││ 2 2 │
O
NH
М.м. 181,1.
2
Фирменное название: 035956.
4. Производное баста, по которому ведется
газохроматографическое определение - метил-4-(метокси)(метил)-фосфинил-2-ацетамид-бутират (по номенклатуре
ИЮПАК).
OCH
│ 3 C
H NO P
CH P --CH -CH -CH-COOCH 9 18 5
3││ 2 2 │ 3
O NH М.м. 251,25.
│
O=C-CH
3
Фирменное название: ХОЕ 064706.
5. Производное метаболита баста, по
которому производится его хроматографическое определение,
метил-3-(метокси)(метил)фосфинопропионат (по номенклатуре ИЮПАК).
OCH
│ 3 C
H O P
CH P --CH -CH -COOCH 6 13 4
3││ 2 2
3
O М.м. 180,16.
Фирменное название: ХОЕ 070951.
Методика
определения баста
в яблоках, бананах, семенах рапса
Принцип метода определения в яблоках и
бананах
Баста и продукт его разложения (ХОЕ
061517) извлекают из пробы водой. Аликвотную часть экстракта нагревают и
проводят получение производных с триметилортоацетатом.
После очистки на мини-колонке с силикагелем производные определяют методом
газожидкостной хроматографии с ПФД или ТИД.
Реактивы и растворы
Этанол, ректификат.
Этилацетат, ч.д.а.
Метанол, х.ч.
Метилацетат, х.ч.
Смесь метилацетата
и метанола (1:1, об./об.).
Смесь метаилацетата
и толуола (1:1, об./об.).
Уксусная кислота, ч.д.а.,
концентрированная.
Триметилортоацетат.
Силикагель 60. Силикагель сушат в течение
около 6 часов при 130 °C, а затем увлажняют до содержания воды 4%. Однородность
увлажнения достигается вращением в течение нескольких часов в ротационном
испарителе вакуума.
Стандарты:
баста - ХОЕ 039866 99% фирмы ХЕХСТ АГ;
метаболит баста -
ХОЕ 061517 99% фирмы ХЕХСТ АГ;
-"- - ХОЕ 035956 98% фирмы ХЕХСТ;
-"- - ХОЕ 064706 98% фирмы ХЕХСТ АГ;
-"- - ХОЕ 070951 99% фирмы ХЕХСТ АГ.
Приготовление стандартных растворов
- Стандартный раствор:
Баста ХОЕ 039866.
109 мг ХОЕ 039866, что соответствует 100
мг ХОЕ 035956, растворяют в 100 мл 1-процентного водного раствора аммиака
(раствор "а").
Берут 250 мкл
раствора "а" и доводят объем раствора 1-процентным аммиаком до 50 мл.
Конечная концентрация 5 мкг/мл ХОЕ 035956 в виде ХОЕ 039866.
Берут 500 мкл
раствора "а" и доводят объем жидкости до 50 мл. Конечная концентрация
10 мкг/мл ХОЕ 035956 (в пересчете на ХОЕ 039866).
Берут 1 мл раствора "а" и
доводят объем жидкости до 50 мл. Конечная концентрация 20 мкг/мл ХОЕ 035956 в
пересчете на ХОЕ 039866.
- ХОЕ 035956. 100 мг ХОЕ 035956
растворяют в 100 мл 1-процентного водного раствора аммиака. Отбирают из этого
раствора 250, 500 мкл, 1 мл и доводят объем
1-процентным водным раствором аммиака до 50 мл. Конечные концентрации
стандартных растворов составляют 5, 10, 20 мкг/мл ХОЕ 035956 соответственно.
- ХОЕ 061517. 84 мг ХОЕ 061517, что
соответствует 100 мг ХОЕ 035956, растворяют в 100 мл 1-процентного водного
раствора аммиака, отбирают 250, 500 мкл, 1 мл,
доводят объем жидкости до 50 мл. Конечные концентрации стандартных растворов
составляют 5, 10, 20 мкг/мл ХОЕ 035956 в пересчете на ХОЕ 061517.
Срок хранение растворов - 6 мес.
- ХОЕ 064706. 139 мг ХОЕ 064706, что
соответствует 100 мг ХОЕ 035956, растворяют в 5 мл 50-процентного этанола и
доводят объем раствора до 100 мл метилацетатом
(раствор "а"). Отбирают 10 мл раствора "а" и доводят объем
жидкости метилацетатом до 100 мл (раствор
"б").
Отбирают 10 мл раствора "б" и
доводят объем жидкости до 100 мл метилацетатом
(раствор "в").
Из раствора "в", содержащего 1 нг/мкл ХОЕ 035956 в пересчете на
ХОЕ 064706, готовят свежие растворы для газохроматографического определения
путем разбавления смесью метилацетата и метанола 1:1
(об./об.), содержащие
соответственно 50 - 200 мкг/мл ХОЕ 035956 в пересчете на ХОЕ 064706.
Приборы
Газовый хроматограф с детектором
пламенной фотометрии, может с ТИД.
Ультразвуковая баня (Брансоник
52) или обычная водяная баня.
Ротационный вакуум-выпарной аппарат (Бюхи W 24 N) или типа ИР-1М, ТУ 25-11-917-74.
Нагреватель для круглодонных колб, 50 мл
(Герхарт SV3).
Фильтр типа Millex
SR (Миллипорэ, SLSR 025 NS).
Шприцы одноразового пользования (насадка Люэра), 10 мл, с канюлей с уплощенной иглой, длина канюли
приблизительно 10 см.
Инъекционный микрошприц,
10 мкл.
Магнитная мешалка с ядром, длина 6 см,
диаметр 0,8 см.
Колба Эрленмайера,
500 мл, широкогорлая.
Круглодонные колбы, 50 мл, NS 29.
Пастеровские пипетки.
Измерительные колбы, 5 мл.
Интенсивный охладитель, 30 см, NS 29.
Часовое стекло 0,15 см.
Подготовка пробы
Пробу перед анализом тщательно галогенизируют.
Ход анализа при
определении баста и его метаболита
в яблоках и бананах
Извлечение и очистка экстракта
Гомогенизируют 25 г
образца (W), прибавляют 200 мл воды
(V = 200 мл
1
воды + 25 г
навески = 225 мл), накрывают эоловым
стеклом и оставляют на
30 мин. при постоянном перемешивании. Центрифугируют
60 мл смеси в течение
10 мин. при 3000
об./мин. Отбирают 20 мл
верхнего слоя (T ) и испаряют его
1
в круглодонной
колбе емк. 50 мл досуха. Прибавляют для удаления остаточной
воды 3 - 5 мл
этилацетата и испаряют еще раз досуха.
Получение производного
(дериватизация)
Сухой остаток 15 мин. суспендируют
без нагревания с 2 мл концентрированной уксусной кислоты с помощью
ультразвуковой бани (можно встряхивать вручную). К суспензии дают 8 мл триметилортоацетата и обрабатывают его опять на бане. Затем
нагревают суспензию с обратным холодильником в течение 4-х часов на
электроплитке или песчаной бане, периодически встряхивая колбу вместе с
холодильником. К реакционному раствору три раза добавляют по 15 мл толуола и каждый раз испаряют его при 50 °C до объема ~ 0,5
- 1 мл (до удаления запаха уксусной кислоты). Доводят объем раствора толуолом
до 3 мл и засасывают его в шприц разового пользования. После этого добавляют в
колбу 15 мл этилацетата, упаривают до 3 - 5 мл, засасывают его в тот же шприц и
тщательно перемешивают растворитель. Далее проводится очистка на мини-колонке с
силикагелем.
Очистка на мини-колонке с силикагелем
В
пастеровскую пипетку, закрытую
с одного конца стеклянной ватой,
отвешивают 0,6 г
силикагеля (4% влажности).
Колонку кондиционируют
пропусканием 5
мл смеси метилацетата и толуола (1:1; об./об.). Через фильтр
типа Millex SR, который
насаживают на шприц
одноразового пользования,
раствор переносят
на мини-колонку с
силикагелем. Колбу, в
которой
происходила дериватизация, промывают 10 мл метилацетата.
Этот раствор также
переносят через
тот же фильтр.
Затем колонку подключают к
несильному
вакууму, отсасывают
досуха. Дериваты действующего вещества и метаболиты
элюируют метилацетатом-метанолом (1:1; об./об.) и собирают первые 5 мл для
определения действующего вещества
и метаболита в градуированную
измерительную колбу
<1>. Элюат (V
= 5 мл),
содержащий действующее
2
вещество,
анализируют методом газовой хроматографии.
--------------------------------
<1> Элюентное
свойство каждой порции силикагеля следует проверить соответственно обработанным
контрольным образцом, к которому добавляют после проведения дериватизации
ХОЕ 064706 и ХОЕ 070951. Элюентное свойство можно
оптимизировать при необходимости путем изменения элюентных
объемов или элюентной интенсивности растворителей.
Измерение методом газовой хроматографии
Измерение методом газовой хроматографии
можно провести или отдельно для действующего вещества и метаболита на
насадочной колонке, или для обоих компонентов совместно на "мэгаборе"-колонке.
Измерение методом газовой хроматографии
на насадочной колонке ХОЕ 064706
Часть
(T )
раствора (V ), полученного после дериватизации и очистки,
1 2
вводят в газовый
хроматограф.
Типичные условия для газовой
хроматографии
Прибор фирмы Carlo
Erba 2150 (Цвет-108) - в скобках приведены условия
определения с ТИД.
Колонка типа: насадочная
стат. фаза: Ультрабонд Carbowax 20M или (3%
OV-17)
длина: 1 м
внутренний диаметр: 2
мм (3 мм)
материал: стекло
Газ-носитель: 30 мл/мин., азот (23 мл/мин.)
Горючая смесь: 70 мл/мин., водород (14 - 17 мл/мин.)
100 мл/мин., воздух
(400 мл/мин.)
Инъектор: стандартный инъектор для насадочных колонок
Детектор: детектор пламенной фотометрии
Ф-фильтр 52 нм или (ТИД)
Температуры: инъектор: 225
°C (225 °C)
детектор: 225 °C -
колонка: 200 °C
(220 °C)
Инъекционный объем: 2 мкл
Время удерживания: ХОЕ 070951: прибл. 1,5
мин. (3,25 мин.).
Часть (T )
раствора (V ), полученного после дериватизации и очистки,
4 2
вводят в газовый
хроматограф.
Прибор: Фирмы Carlo
Erba 2150 (Цвет-106)
Колонка типа: насадочная
стат. фаза: Ультрабонд Carbowax 20M (OV -
17,3%)
длина: 1,8 м (1 м)
материал: стекло
Газ-носитель: 25 мл/мин., азот (23 мл/мин.)
Горючая смесь: 70 мл/мин., водород (14 - 17 мл/мин.)
100 мл/мин., воздух
(400 мл/мин.)
Инъектор: стандартный инъектор для насадочных колонок
Детектор: детектор пламенной фотометрии
Ф-фильтр 52 нм (ТИД)
Температуры: инъектор: 225
°C (225 °C)
детектор: 225 °C -
колонка: 190 °C
(170 °C)
Инъекционный объем: 2 мкл
Время удерживания: прибл. 1,5 мин. (1,5
мин.)
Измерение методом газовой хроматографии на
"мэгаборе"-колонке
Для определения обоих компонентов в одном
измерении вводят часть (T )
4
раствора (V ), полученного
после дериватизации и
очистки, в газовый
2
хроматограф.
Типичные условия для газовой хроматографии:
Прибор: Фирмы Carlo
Erba 2150
Колонка типа: капиллярная, средним диаметром
стат. фаза
длина: 1,5 м
внутренний диаметр:
0,53 мм
материал: кварц (Fused Silica)
Газ-носитель: 30 мл/мин., гелий
Газ для продувки: 22 мл/мин., гелий
Горючая смесь: 70 мл/мин., водород
120 мл/мин., воздух
Инъектор: инъектор
типа Chrompack 8046
(стеклянная
вставка с кварцевой ватой типа
Schimadzu 201-47616)
Температуры: инъектор: 250
°C
детектор: 225 °C
Детектор: детектор пламенной фотометрии
Ф-фильтр 52 нм
Колонка (программ температур): 150 °C, 2
мин., 39 °C/мин., 220 °C,
3 мин.
Инъекционный объем: 2 мкл
Время удерживания: ХОЕ 070951: прибл. 1 мин.
ХОЕ 064706: прибл. 4
мин.
Оценка результатов
Способ оценки
Оценку проводят путем сравнения площадей
или высот пиков обработанных растворов образцов с площадями или высотами пиков
от стандартного раствора известной концентрации <1>. Объемы исследуемых
растворов в стандартных растворах должны быть по возможности одинаковы: притом
площади или высоты пиков, полученных от растворов, должны быть соизмеримы.
--------------------------------
<1> Если
вещества с матрицей и без таковой показывают различную чувствительность
показания в детекторе, то оценка производится по сравнению с обработанными
контрольными растворами, к которым добавлен дериват газовой хроматографии в
конечный раствор.
Расчеты остаточных количеств
Остаточное количество ХОЕ 039866 в
пересчете на ХОЕ 035956:
V
x V x V x
V x M
x F
1 2
3 4 t
s
N (мг/кг) = --------------------------- x F,
W x T x T x T x
T x F
1 2
3 4 t
где:
N - остаточное количество в мг/кг;
F -
площадь (высота) пика исследуемого образца (кв. см или см);
s
F -
площадь (высота) пика стандарта (кв. см или см);
t
V -
общий объем водного раствора из образца в г (= мл);
1
T -
частичный объем раствора, взятого из центрифугата
(мл);
1
W - навеска исследуемого образца (г);
V -
конечный объем для определения путем газовой хроматографии (мл);
2
M -
количество вещества ХОЕ 064706 (в виде нг ХОЕ
035956), введенного
t
в колонку;
T -
количество определяемого раствора (мкл), введенного в
колонку;
4
F - коэффициент эффективности метода;
T +
T - частичные объемы в случае
разведений;
2
3
V +
V - объемы в случае разведений.
2
4
Остаточное количество ХОЕ 061517 в
пересчете на ХОЕ 035956:
V x
V x V
x V x M x F
1 2
3 4 t
s
N (мг/кг) = --------------------------- x F,
W x T x T x
T x T
x F
1 2
3 4 t
где:
N - остаточное количество в мг/кг;
F -
площадь (высота) пика исследуемого образца (кв. см или см);
s
F -
площадь (высота) пика стандарта (кв. см или см);
t
V -
общий объем водного раствора из образца в г (= мл);
1
T -
частичный объем раствора, взятого из центрифугата
(мл);
1
W - навеска исследуемого образца (г);
V -
конечный объем для определения путем газовой хроматографии (мл);
2
M -
количество вещества ХОЕ 070951 (в виде нг ХОЕ
035956), введенного
t
в колонку;
T -
количество определяемого раствора (мкл), введенного в
колонку;
4
F -
коэффициент эффективности метода;
T +
T - частичные объемы в случае
разведений;
2
3
V +
V - объемы в случае разведений.
2
4
Ход анализа при
определении баста
и его метаболита в семенах рапса
Извлечение и очистка экстракта
В
колбу Эрленмайера емкостью
500 мл добавляют
к 25 мл г
гомогенизированного
образца (W) 200
мл воды (V =
200 мл +
25 г
1
навески = 225
мл). После покрытия
с часовым стеклом образец
извлекают в
течение 30 мин.
при размешивании при комнатной температуре. После осаждения
твердых компонентов
декантируют 40 мл (T ) водного раствора,
к этой
1
аликвотной части
добавляют 40 мл
ацетона. Для отделения
выделяемых
компонентов
кратную часть центрифугируют в течение 5 мин. при 3000 об./мин.
(V = 80 мл), 40 мл верхнего слоя (T ) переводят в делительную воронку емк.
2 2
100 мл и
встряхивают с 20 мл дихлорметана. Органическая фаза (нижняя фаза)
отделяется и реэкстрагируется два раза с 10 мл воды. Водную фазу из
первого
извлечения и
после очистки дихлорметаном объединяют
и испаряют в
круглодонной
колбе при 60 °C на ротационном выпарном аппарате досуха. После
этого добавляют
несколько миллилитров этилацетата для удаления остаточной
воды и опять
испаряют досуха.
Дериватизация
Сухой остаток суспендируют
с 2 мл концентрированной уксусной кислоты с помощью ультразвуковой бани (прибл.
15 мин.) или встряхивают. К этой суспензии добавляют 8 мл триметилортоацетата
и обрабатывают его опять в ультразвуковой бане. Потом нагревают суспензию с
обратным холодильником в течение 4 часов на электроплитке. После охлаждения
реактивного раствора добавляют 15 мл толуола и испаряют на ротационном
испарителе при 40 °C до остаточного объема в 0,5 мл. Этот процесс повторяется
еще два раза по 15 мл (до удаления запаха уксусной кислоты). Остающийся в колбе
раствор (0,5 - 1,0 мл) доводят толуолом до 3 мл и засасывают его в шприц
одноразового пользования на 10 мл. Затем колбу промывают пропусканием 35 мл метилацетата. Этот раствор также засасывают в шприц и
тщательно смешивают его взбалтыванием.
Очистка на мини-колонке с силикагелем
В пастеровскую пипетку, закрытую с одного
конца стеклянной ватой, отвешивают 0,6 г силикагеля, подвергающегося
соответственной предварительной обработкой. Колонку кондиционируют пропусканием
5 мл смеси метилацетата и толуола (1:1; об./об.).
Через фильтр типа Millex
SR, который насаживают на шприц одноразового пользования, раствор переносят на
мини-колонку с силикагелем. Колбу после дериватизации
промывают 10 мл метилацетата. Этот раствор,
засосанный в шприц, также переносят на мини-колонку с силикагелем. Затем
колонку подключают к несильному вакууму, отсасывают досуха. Дериваты
действующего вещества и метаболита элюируют метилацетатом-метаном (1:1; об./об.) и собирают первые 5 мл. Элюат
испаряют при 40 °C на ротационном выпарном аппарате до остаточного объема
прибл. 0,5 мл, добавляют два раза по 5 мл толуола и испаряют, каждый раз после
добавления толуола до прибл. 0,5 мл.
Вышеназванная очистка
на мини-колонке с
силикагелем повторяется еще
раз с 0,4
г предварительно обработанного силикагеля. При второй очистке
применяется для
промывания 7 мл метилацетата. После того,
как колонку
подключают к
несильному вакууму и
отсасывают ее досуха,
дериваты
действующего вещества
и метаболита элюируют метилацетатом-метаном
(1:1; об./об.) и
собирают первые 5 мл. Элюат (V = 5 мл) подвергается
3
конечному
газохроматографическому определению.
Элюентное свойство каждой порции силикагеля следует проверить соответственно
обработанным контрольным образцом, к которому добавляют после дериватизации ХОЕ 064706 и ХОЕ 070951. Элюентное
свойство можно оптимизировать при необходимости путем изменения элюентных объемов или элюентной
интенсивности растворителей.
Измерение методом газовой хроматографии и
расчет остаточных количеств проводят так, как описано
выше.
Эффективность метода при добавлении 0,05
- 0,2 мг/кг ХОЕ 039866 или продукта разложения ХОЕ 061517 к необработанным
контрольным образцам соответствовала 90 - 110%, в среднем 95% в пересчете на
ХОЕ 035956. Предел практического определения составлял 0,05 мг/кг ХОЕ 039866
или ХОЕ 061517 в пересчете на ХОЕ 035956.
Методические указания разработаны
специалистами фирмы ХЕХСТ, апробированы и модифицированы с учетом
отечественного оборудования специалистами ВНИИГИНТОКС.