Утверждена

Главным управлением

ветеринарии Госагропрома СССР

18 июня 1986 года

 

МЕТОДИКА

ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРИТОВ И НИТРАТОВ В КОРМАХ, ОВОЩАХ,

БАХЧЕВЫХ КУЛЬТУРАХ, КРОВИ, ПАТОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ,

МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ

 

1. Принцип метода

 

Метод определения нитритов основан на фотометрическом измерении интенсивности окраски азосоединения розово-малинового цвета, образующегося при реакции нитритов с альфа-нафтиламином и сульфаниловой кислотой (реактив Грисса) в кислой среде после водного извлечения их из исследуемых проб.

Реакция специфична для нитритов.

Метод определения нитратов основан на водном извлечении их из исследуемых проб, количественном восстановлении нитратов в нитриты и последующем определении нитритов с реактивом Грисса.

 

2. Метрологическая характеристика метода

 

Предел определения нитритов составляет 0,05 мг/кг (мг/л), степень определения нитритов 90 +/- 10%.

Предел определения нитратов составляет 0,5 мг/кг (мг/л), степень определения нитратов 83 +/- 17%.

 

3. Реактивы и растворы

 

Сульфаниловая кислота, ч.д.а., ГОСТ 5821-69.

Альфа-нафтиламин, ч.д.а., ГОСТ 8827-57.

Барий сернокислый, ч.д.а., ГОСТ 3158-75.

Цинковая пыль, порошок цинка.

Лимонная кислота, х.ч. или ч.д.а., ГОСТ 3652-69.

Марганец сернокислый, ч.д.а., ГОСТ 435-67.

    Натрий азотистокислый (NaNO ), х.ч., ГОСТ 4197-66.

                               2

    Калий азотнокислый (KNO ), х.ч., ГОСТ 4217-65.

                           3

Сульфаминовая кислота, т.ч., ТУ 6-09-2437-79 или ТУ 6-09-2437-79.

Уксусная кислота концентрированная (ледяная), ГОСТ 61-69.

12-процентный водный раствор уксусной кислоты.

1-процентный водный раствор сульфаминовой кислоты.

Уголь активированный марки Б или уголь активированный в таблетках (аптечный).

Натрий гидроокись, х.ч., ГОСТ 4328-77.

Цинк сернокислый, ч.д.а., ГОСТ 4374-77.

Приготовление реактива Грисса:

а) 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 150 мл 12-процентного раствора уксусной кислоты;

б) 0,1 г альфа-нафтиламина растворяют (при нагревании) в 20 мл дистиллированной воды, фильтруют и смешивают со 150 мл 12-процентного раствора уксусной кислоты.

Перед употреблением одну часть раствора "а" смешивают с равной по объему частью раствора "б". Растворы "а" и "б" хранят отдельно в холодильнике, при необходимости - в течение 6 мес.

    Приготовление  стандартного раствора нитрита натрия: 0,15 г высушенного

до  постоянной  массы  при  температуре  80  °С  NaNO    растворяют  в  1 л

                                                     2

дистиллированной  воды, свободной от нитритов. 1 мл этого раствора содержит

0,1  мг (100 мкг) NO . Раствор хранят в холодильнике, он устойчив в течение

                    2

месяца.

    Приготовление  рабочего  раствора  нитрита  натрия:  25  мл полученного

стандартного раствора переносят в мерную колбу на 500 мл и доводят объем до

метки дистиллированной водой. Раствор должен быть свежеприготовленным, 1 мл

его  содержит  0,005 мг (5 мкг) NO . Этот раствор используют для построения

                                  2

калибровочной кривой.

    Приготовление  стандартного  раствора  нитрата калия: растворяют 1,63 г

нитрата   калия,   высушенного   до   постоянной   массы   при  105  °С,  в

дистиллированной  воде  в  мерной  колбе на 1 л и доводят объем раствора до

метки   дистиллированной   водой.   1  мл  этого  раствора  содержит  1  мг

нитрат-ионов (NO ). Раствор можно хранить в холодильнике в течение 3 мес.

                3

    Приготовление рабочего раствора нитрата калия: в мерную колбу на 100 мл

переносят пипеткой 1 мл стандартного раствора нитрата калия и доводят объем

раствора  в  колбе  до метки 12-процентным раствором уксусной кислоты. 1 мл

этого  раствора  содержит  0,01  мг  (10  мкг)  NO .  Раствор  должен  быть

                                                  3

свежеприготовленным.  Этот  раствор используют для построения калибровочной

кривой.

Приготовление реактива для восстановления нитратов в нитриты:

а) барий сернокислый, высушенный при 100 °С до постоянной массы, - 100 г;

б) марганец сернокислый, прокаленный при 200 °С в течение часа, - 10 г;

в) цинковая пыль - 2 г;

г) лимонная кислота - 75 г;

д) сульфаниловая кислота - 4 г;

е) альфа-нафтиламин - 2 г.

Каждый реактив тщательно растирают в ступке, затем к реактиву "а" в ступке последовательно добавляют реактивы "б", "в", "д", "е", "г" и тщательно перемешивают до получения однообразной массы. Полученный реактив хранят в склянке из темного стекла, он пригоден для использования в течение 2 лет.

Приготовление 12-процентного раствора уксусной кислоты: 120 мл ледяной уксусной кислоты смешивают с 880 мл дистиллированной воды.

Приготовление 1-процентного раствора сульфаминовой кислоты: 1 г сульфаминовой кислоты растворяют в 99 мл дистиллированной воды.

Приготовление 0,5 М раствора гидроокиси натрия: 20 г NaOH растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и доводят объем в колбе до метки дистиллированной водой.

Приготовление 5-процентного раствора сульфата цинка: 5 г сульфата цинка растворяют в 95 мл дистиллированной воды.

 

4. Приборы и посуда

 

    Химические  пробирки;  пробирки  с  притертыми  пробками;  центрифужные

пробирки;  пипетки  на  1,  5,  10,  20  мл; мерные колбы на 100 и 1000 мл;

конические колбы на 100, 250 мл; химические стаканы на 100, 200 мл; мешочки

для диализа или пленка для диализа N  (выпускается картонажными фабриками);

                                    3

цилиндры  на  10, 50 и 100 мл; химические воронки; песочные часы на 2 мин.;

фотоэлектроколориметр;   центрифуга   на  5000  -  6000  об./мин.;  фильтры

обеззоленные среднепористые.

Пленку или мешочки для диализа перед использованием для анализа помещают на 30 - 40 мин. в дистиллированную воду. Во всех случаях при проведении диализа пленку следует брать с запасом по отношению к пробе так, чтобы узел мешочка при проведении диализа не был опущен в воду.

 

5. Построение калибровочных кривых

 

Калибровочная кривая для определения нитритов: в 11 химических пробирок наливают рабочий раствор нитрита натрия в количествах, указанных в таблице. Затем в пробирки наливают дистиллированную воду до объема 10 мл, приливают по 1 мл реактива Грисса и энергично встряхивают.

 

ТАБЛИЦА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ШКАЛЫ СТАНДАРТОВ НА НИТРИТЫ

 

┌─────┬──────────┬──────────────┬─────┬───────────┬──────────────┐

│N    │Количество│Содержание NO │N    │Количество │Содержание NO │

│про- │ рабочего │             2│про- │ рабочего  │             2│

│бирки│ раствора,├───────┬──────┤бирки│ раствора, ├──────┬───────┤

│     │    мл    │  мг   │ мкг  │     │    мл     │  мг  │  мкг  │

├─────┼──────────┼───────┼──────┼─────┼───────────┼──────┼───────┤

│1    │0,1       │0,0005 │0,5   │7    │1,2        │0,006 │6,0    │

│2    │0,2       │0,0010 │1,0   │8    │1,4        │0,007 │7,0    │

│3    │0,4       │0,0020 │2,0   │9    │1,6        │0,008 │8,0    │

│4    │0,6       │0,0030 │3,0   │10   │1,8        │0,009 │9,0    │

│5    │0,8       │0,0040 │4,0   │11   │2,0        │0,010 │10,0   │

│6    │1,0       │0,0050 │5,0   │     │           │      │       │

└─────┴──────────┴───────┴──────┴─────┴───────────┴──────┴───────┘

 

Для построения калибровочной кривой через 15 мин. после начала окрашивания определяют оптическую плотность растворов на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм), кюветы - 10 мм, раствор для сравнения - дистиллированная вода.

Затем на оси абсцисс откладывают количество нитрит-ионов (мкг), а на оси ординат - найденные значения оптической плотности растворов и проводят кривую через точки пересечения.

Эта же шкала стандартов может быть использована для визуального сравнения с опытными пробами.

Калибровочная кривая для определения нитратов. Для приготовления шкалы стандартов в 7 химических пробирок с притертыми пробками или в 7 центрифужных пробирок с притертыми пробками последовательно прибавляют по 0,3 г реактива для восстановления нитратов, затем приливают рабочий раствор и 12-процентную уксусную кислоту в количествах, указанных в таблице (общий объем составляет 10 мл).

 

ТАБЛИЦА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ШКАЛЫ СТАНДАРТОВ НА НИТРАТЫ

 

┌──────────┬────────────┬────────────────┬───────────────────────┐

│N пробирки│ Количество │              - │Количество 1-процентной│

│          │  рабочего  │ Содержание NO  │ уксусной кислоты, мл  │

│          │раствора, мл│              3 │                       │

│          │            ├────────┬───────┤                       │

│          │            │   мг   │  мкг  │                       │

├──────────┼────────────┼────────┼───────┼───────────────────────┤

│1         │0,0         │0,0     │-      │10,0                   │

│2         │1,0         │0,010   │10     │9,0                    │

│3         │2,0         │0,020   │20     │8,0                    │

│4         │4,0         │0,040   │40     │6,0                    │

│5         │6,0         │0,060   │60     │4,0                    │

│6         │8,0         │0,080   │80     │2,0                    │

│7         │10,0        │0,100   │100    │0,0                    │

└──────────┴────────────┴────────┴───────┴───────────────────────┘

 

Затем пробирки или центрифужные пробирки закрывают пробками и энергично встряхивают в течение ровно 2 мин. Через 10 мин. пробы центрифугируют в центрифужных пробирках при 5 - 6 тыс. об./мин. в течение 5 мин. Далее проводят колориметрическое определение интенсивности окраски раствора при длине волны 540 нм, кюветы - 10 мм, раствор для сравнения - 12-процентный раствор уксусной кислоты, обработанный, как пробы, сухим восстановителем и прошедший центрифугирование, - пробирка N 1.

Затем на оси абсцисс откладывают количество нитрат-ионов (мкг), а на оси ординат - найденные значения оптической плотности растворов и проводят кривую через точки пересечения.

Эта же шкала стандартов может быть использована для визуальных определений.

 

6. Ход определения

 

Корма. Для исследования измельчают пробу кормов и берут навеску 2 - 10 ч. Извлечение нитритов и нитратов из проб кормов проводят методом диализа. Для этого точно отмеривают 50 - 100 мл дистиллированной воды и используют этот объем для всех дальнейших операций с пробой. Пробу помещают в мешочек или пленку для диализа, приливают туда небольшое количество дистиллированной воды из первоначального объема (50 или 100 мл). Воды приливают столько, чтобы она хорошо смочила пробу. Далее пленку завязывают в виде мешочка, весь оставшийся объем дистиллированной воды (от 50 или 100 мл) наливают в химический стаканчик, опускают мешочек в стакан таким образом, чтобы полностью погрузить пробу в воду, и оставляют ее для проведения диализа в течение 1,5 - 2 ч. Затем, не вынимая мешочков из стаканов, пипеткой отбирают 10 мл диализата для анализа на нитриты и 5 мл для анализа на нитраты и проводят анализ, как описано ниже.

Кровь, органы и ткани животных. Для анализа берут 20 - 50 мл крови, 2 - 10 г органов или тканей животных, помещают пробу в диализный мешочек и опускают в химический стаканчик, в который наливают соответственно 50 - 100 мл прокипяченной горячей дистиллированной воды. Через 1,5 - 2 ч пипеткой отбирают из стакана 10 мл диализата для анализа на нитриты и 5 мл для анализа на нитраты и проводят анализ, как описано ниже.

Если раствор в стакане после диализа имеет окраску или муть, анализ следует проводить после удаления пигментов или мути. Пигменты, окрашивающие диализат, удаляют путем фильтрования небольшого объема диализата через воронку с бумажным фильтром, заполненным на 2/3 активированным углем. Уголь на фильтре предварительно промывают 50 мл прокипяченной дистиллированной воды, которую отбрасывают. Затем через этот фильтр отфильтровывают объем диализата, необходимый для анализа на нитриты и нитраты. В случае необходимости проводят повторное фильтрование этого раствора через свежую порцию активированного угля, промытого водой, до полного исчезновения окраски диализата.

При наличии в диализате мути проводят осаждение белков смесью 0,5 М раствора NaOH и 5-процентного раствора сульфата цинка в объемном отношении 2:5. Для этого отбирают из стакана 30 мл диализата, переносят его в другой стаканчик или колбу, добавляют 10 - 20 мл вышеуказанной смеси. После выпадения осадка диализат фильтруют, измеряют объем фильтрата и отбирают 5 мл для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты.

В этом случае при расчете по формуле содержания нитратов и нитритов за общий объем фильтрата следует принимать сумму объема диализата, оставшегося в первом стаканчике (20 мл), и объема фильтрата, измеренного после осаждения белков и фильтрования.

Молоко, молозиво, обрат, сухое молоко, заменитель цельного молока (ЗЦМ). Отбирают 20 - 50 мл молока или молозива, переносят в пленку для диализа и приливают туда 2 - 4 мл 12-процентной уксусной кислоты, перемешивают содержимое стеклянной палочкой, завязывают пленку и опускают ее в стакан, содержащий 50 - 100 мл горячей прокипяченной дистиллированной воды. Затем через 1,5 - 2 ч отбирают 5 мл диализата для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты и проводят анализ, как описано ниже. В том случае, если в растворе после диализа есть муть, необходимо провести осаждение белков. Для этого отбирают 20 - 30 мл диализата, добавляют 10 - 20 мл смеси 0,5 М раствора NaOH и 5-процентного раствора сульфата цинка в объемном отношении 2:5. После выпадения осадка диализат фильтруют, измеряют объем фильтрата и отбирают пипеткой 5 мл для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты.

Общий объем диализата при этом будет составлять сумму первоначального объема диализата, оставшегося в первом стакане и измеренного после фильтрования объема.

Сухого молока, ЗЦМ для анализа берут 2 - 5 г, помещают в пленку для диализа, хорошо смачивают пробу небольшим объемом дистиллированной воды, приливают туда 2 - 4 мл 12-процентной уксусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой, завязывают пленку и опускают ее в стакан, содержащий 50 - 100 мл горячей дистиллированной воды, диализ проводят в течение 1,5 - 2 ч. При расчете общего объема воды необходимо учесть объем воды, взятый для смачивания пробы.

Анализ проводят, как описано для проб молока.

Обрата для анализа берут 20 - 50 мл, приливают к нему 20 - 50 мл дистиллированной воды, хорошо перемешивают в течение 10 мин. и отбирают 5 мл для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты. Если в растворе есть муть или опалесценция, необходимо проводить осаждение белков, как указано выше.

Картофель, сахарная свекла, огурцы, капуста, лук, редька и другие овощи и бахчевые культуры, дающие с водой неокрашенные растворы. После измельчения проб берут навеску 2 - 10 г, помещают в колбу и заливают 50 - 100 мл дистиллированной воды. Перемешивают в течение 10 - 15 мин. и отбирают аликвотные количества для анализа на нитраты и нитриты. В том случае, если раствор имеет окраску, проводят фильтрование небольшого объема экстракта через активированный уголь, как описано выше.

 

7. Проведение определения

 

После того как в пробирку отобрано 10 мл диализата для анализа на нитриты, туда добавляют 1 мл реактива Грисса (раствор "а" смешивают с раствором "б" в равных объемных частях), встряхивают содержимое пробирки и через 15 мин. после появления окраски проводят измерение оптической плотности раствора на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм) против дистиллированной воды в кюветах с рабочей длиной 10 мм.

Для анализа на нитраты отбирают 5 мл диализата в пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно насыпано 0,3 г сухого восстановителя, приливают туда же 5 мл 12-процентной уксусной кислоты, закрывают пробирку пробкой и энергично встряхивают ее в течение точно 2 мин.

В параллельную пробирку насыпают 0,3 г сухого восстановителя и наливают 10 мл 12-процентной уксусной кислоты, закрывают ее пробкой и встряхивают в течение 2 мин. (пробирка для сравнения) при измерении оптической плотности пробы.

Через 10 мин. переливают содержимое пробирок в центрифужные пробирки и центрифугируют при 5 - 6 тыс. об./мин. в течение 5 мин. После этого проводят колориметрирование проб на ФЭКе при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм, кюветы с рабочей длиной 10 мм). В качестве раствора для сравнения используют "холостой" раствор - раствор уксусной кислоты, обработанный сухим восстановителем, как описано выше.

В том случае, если в пробах устанавливается наличие большого содержания нитритов - свыше 20 мкг (интенсивная окраска в пробирке), их следует удалять, так как они несколько завышают результаты определения нитратов. Для удаления нитритов к диализату в стакане, соответственно 50 или 100 мл, прибавляют 2 - 4 мл 1-процентного раствора сульфаминовой кислоты, перемешивают раствор стеклянной палочкой и оставляют на 5 мин. После этого отбирают 5 мл диализата для анализа на нитраты и проводят анализ, как описано выше. При расчетах учитывают увеличение общего объема пробы.

После колориметрирования проб по соответствующим калибровочным кривым находят количество нитритов и нитратов, подставляют их в формулу для расчета (в мкг) и определяют содержание нитратов и нитритов.

Если при определении нитратов образуется очень интенсивная окраска, не укладывающаяся при определении оптической плотности в пределы калибровочной кривой, необходимо повторить определение, взяв меньшее аликвотное количество диализата для анализа, например 0,1 мл, и довести анализируемый объем до 10 мл 12-процентной уксусной кислотой. Далее провести анализ, как указано выше, учитывая при расчетах разведение этого раствора.

Однако если определяется очень высокое содержание нитратов (г/кг), необходимо повторить анализ данной пробы, соответственно уменьшая навеску и увеличивая объем дистиллированной воды для диализа. Можно также после проведения диализа в первый раз и установления высокого содержания нитратов прибавить в стакан к прежнему диализату, в котором находится мешочек с пробой, еще 100 мл дистиллированной воды и провести дополнительный диализ в течение часа. После этого взять аликвотное количество для анализа и провести анализ на нитраты. При расчетах необходимо учесть это разведение диализата, в данном случае в 2 раза, т.е. общий объем диализата при этом составил не 100, а 200 мл.

 

8. Расчет результатов анализа

 

Расчет результатов анализа проводят по формуле:

 

                                    В х У

                                         1

                                Х = ------,

                                    А х У

                                         2

 

    где:

    Х  -  содержание  нитритов  (нитрит-ионов) или нитратов (нитрат-ионов),

мг/кг;

    В   -   содержание   нитрит-ионов   или   нитрат-ионов,   найденных  по

соответствующим калибровочным кривым, мкг;

    А - навеска анализируемого образца, г;

    У  - общий  объем  фильтрата,  мл (соответственно 50, 100 мл или другие

     1

объемы с учетом разведений);

    У    -   объем   фильтрата,  взятый  для  анализа,  мл  (5  или  10  мл

     2

соответственно).

Поскольку при диализе однородная равновесная концентрация минеральных солей устанавливается во всем объеме раствора (в стакане и в растворе в диализном мешочке), при расчете принимается во внимание весь взятый для анализа объем раствора или дистиллированной воды для анализа.

 

 

 

 

 

КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТГЕМОГЛОБИНА

В КРОВИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

 

1. Принцип метода

 

Метод основан на сравнительном измерении оптической плотности растворов исследуемой крови с исходной концентрацией оксигемоглобина (гемоглобина) и параллельной пробы крови, в которой весь оксигемоглобин окислен до метгемоглобина феррицианидом калия, с использованием фотоэлектроколориметра при красном светофильтре.

 

2. Реактивы и растворы

 

    Аммиак водный (NH OH), ГОСТ 3760-64.

                     4

Калий железосинеродистый (феррицианид калия, соль кровяная красная), ГОСТ 4206-65.

Гепарин (25000 ед.).

Трилон Б (комплексон III, хелатон, двунатриевая соль ЭДТА - двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты).

0,25-процентный раствор аммиака готовят, добавляя к 1 мл аммиака 99 мл дистиллированной воды. Насыщенный раствор феррицианида калия готовят, растворяя 70 г этой соли в 100 мл дистиллированной воды. Раствор можно хранить не более недели. Раствор гепарина готовят путем прибавления к 5 мл гепарина 20 мл дистиллированной воды. Раствор трилона Б готовят путем растворения 50 г препарата в 500 мл дистиллированной воды, подогревая раствор при температуре 80 °С до полного растворения. Теплый раствор фильтруют через микропористый стеклянный фильтр N 3 или 4 или через 4 слоя фильтровальной бумаги.

 

3. Приборы и посуда

 

Химические пробирки.

Пипетки на 1, 10 мл.

Химические воронки или воронки со стеклянным фильтром N 3 или 4.

Фотоэлектроколориметр.

 

4. Подготовка проб к анализу

 

Для анализа у исследуемых животных берут по 1 - 2 мл крови, помещают ее в пробирку и стабилизируют кровь, добавив туда 2 - 3 капли раствора гепарина или трилона Б, перемешивают раствор и закрывают пробирки пробками.

Анализ проб на содержание метгемоглобина лучше проводить непосредственно после доставки проб, но при необходимости стабилизированную кровь хранят в холодильнике при температуре 2 - 4 °С.

Перед исследованием кровь тщательно перемешивают.

 

5. Ход анализа

 

В 2 химические пробирки наливают по 7,3 мл 0,25-процентного раствора аммиака и добавляют по 0,2 мл исследуемой крови (из одной пробы крови). В одну из пробирок (пробирка N 2) добавляют 1 - 2 капли насыщенного раствора феррицианида калия, оставляют на 10 мин. обе пробирки, а затем определяют величину светопоглощения (экстинцию) обоих растворов, используя для сравнения 0,25-процентный раствор аммиака.

    В  первой  пробирке  (пробирке N 1) определяют величину светопоглощения

раствора  крови  с  исходной концентрацией оксигемоглобина  или, что то же,

гемоглобина,  во  второй (пробирка N 2) - величину светопоглощения раствора

крови,  в  которой  весь  оксигемоглобин  (HbO )  превращен в метгемоглобин

                                              2

(МтHb).

Как отмечено выше, содержание оксигемоглобина в исходной пробе крови соответствует содержанию гемоглобина в ней.

Поскольку в параллельной пробе крови (пробирка N 2) весь гемоглобин полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, величина светопоглощения раствора с содержанием метгемоглобина практически постоянная и зависит от исходного уровня гемоглобина (оксигемоглобина).

 

6. Колориметрирование проб

 

Определение светопоглощения растворов крови в обеих пробирках проводят на фотоэлектроколориметре (ФЭК) при красном светофильтре. У ФЭК различных марок длина волны, соответствующая максимуму пропускания при красном светофильтре, бывает различной. Так, у ФЭК-56 при работе с красным светофильтром N 8 длина волны составляет 597 нм, у спектрофотоэлектроколориметров ФЭК-56 ПМ и ФЭК-КФК-2 длины волн при работе с красным светофильтром лежат в интервале 600 - 670 нм.

Определение светопоглощения растворов крови в обеих пробирках проводят с использованием ФЭК различных марок при красном светофильтре в вышеприведенном интервале длин волн, используя для сравнения 0,25-процентный раствор аммиака, в кюветах с рабочей длиной 10 мм.

    Различия,  связанные  с  измерением   экстинций   растворов  крови  при

различающихся  длинах волн при работе на ФЭК различных марок, корригируются

путем  введения  в  расчетную  формулу  коэффициента - величины приведенной

экстинции  раствора  крови  с  исходным  уровнем  оксигемоглобина  (Е  HbO

                                                                          2

привед.), как показано в разделе, - расчет результатов анализа. При расчете

этой  приведенной  величины  используют  измеренные  опытным путем величины

светопоглощения  раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (Е HbO )

                                                                         2

-  пробирка  N  1  и  величины  светопоглощения раствора крови с предельным

содержанием метгемоглобина (Е МтHb) - пробирка N 2.

 

7. Расчет результатов анализа

 

    Предварительно  опытным  путем  на  большой  группе животных двух видов

установлена  средняя  величина  светопоглощения  раствора  крови с исходным

уровнем   оксигемоглобина  (Е  HbO )  и  средняя  величина  светопоглощения

                                  2

раствора  крови  с полученным  уровнем  метгемоглобина (Е МтHb) для  овец и

коров.

    В  пробах  крови  овец  первая величина (Е HbO ) составила 0,15, вторая

                                                  2

(Е МтHb) - 0,57;  для  крупного  рогатого  скота  эти  величины  составляют

соответственно 0,17 и 0,79.

Поскольку гемоглобин в пробе крови полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, изменение светопоглощения, равное 0,42 (0,57 - 0,15) для овец и 0,62 (0,79 - 0,17) для крупного рогатого скота, соответствует 100% содержания метгемоглобина.

Все эти данные были необходимы для выведения коэффициентов при расчете содержания метгемоглобина в крови животных по данной методике.

По методике проводят определение светопоглощения растворов исследуемой крови с исходным уровнем оксигемоглобина (пробирка N 1) и полученным уровнем метгемоглобина (пробирка N 2) и рассчитывают содержание метгемоглобина в крови по нижеприведенным формулам, используя установленные коэффициенты и расчетное приведенное значение светопоглощения раствора оксигемоглобина с учетом коррекции измерения этой величины при красном светофильтре с различающимися длинами волн:

 

                 Х = (Е  - Е ) х 2,38 х 100 (1) для овец,

                       2    1

 

        Х = (Е  - Е ) х 1,61 х 100 (2) для крупного рогатого скота,

              2    1

 

    где:

    Х - содержание метгемоглобина в исследуемой пробе крови, %;

    Е  - приведенное  значение   светопоглощения  раствора  оксигемоглобина

     2

(Е HbO ), расчет его приводится ниже;

      2

    Е   -   среднее    значение    величины    светопоглощения     раствора

     1

оксигемоглобина, равное 0,15 для овец и 0,17 для крупного рогатого скота;

    2,38 и 1,61 - расчетные  коэффициенты,  найденные  из  средних  величин

светопоглощения  растворов  оксигемоглобина  и  метгемоглобина  для  овец и

крупного рогатого скота (расчет их также приводится далее).

    Значение   Е    -   приведенное   значение   светопоглощения   раствора

                2

оксигемоглобина  (Е  HbO   =  Е )  -  находят из пропорции с использованием

                        2      2

измеренных  величин  светопоглощения  раствора крови с исходным содержанием

оксигемоглобина (пробирка N 1) и метгемоглобина (пробирка N 2) в опыте.

 

                       Е    Е               Е  х Е

                        2    4               3    4

                       -- = --, откуда Е  = -------,

                       Е    Е           2      Е

                        3    5                  5

 

    где:

    Е   -  искомая  величина  -  приведенное  значение оптической плотности

     2

раствора оксигемоглобина;

    Е   -  среднее  значение  оптической плотности раствора метгемоглобина,

     3

соответственно  0,57  для  овец  для  расчета  Е   в формулу (1) и 0,79 для

                                                2

крупного рогатого скота в формулу (2);

    Е   - измеренное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина

     4

(пробирка N 1);

    Е   -  измеренное значение оптической плотности раствора метгемоглобина

     5

(пробирка N 2).

    Значение  Е   подставляют  в формулу (1) или (2) для расчета содержания

               2

метгемоглобина в крови овец или крупного рогатого скота.

    Если приведенное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина

(Е )  будет равно или меньше средней величины оптической плотности раствора

  2

оксигемоглобина  (Е   в  формулах N 1 и 2), что объясняется индивидуальными

                   1

колебаниями  содержания  гемоглобина  в  крови, содержание метгемоглобина в

крови  в  этом  случае  будет  равно  или  меньше  2,38 для овец и 1,61 для

крупного рогатого скота.

Коэффициенты 2,38 и 1,61 были рассчитаны из средних показателей оптической плотности растворов метгемоглобина и оксигемоглобина в крови овец и коров соответственно по формулам:

 

    100 х 0,01         100 х 0,01

    ---------- = 2,38, ---------- = 1,61,

       0,42               0,62

 

где:

0,42 - изменение светопоглощения растворов крови овец с содержанием мет- и оксигемоглобина (0,57 - 0,15), соответствующее 100-процентному содержанию метгемоглобина в крови овец;

0,01 - наименьший показатель оптической плотности, т.е.:

 

0,42 - 100

0,01 - Х.

 

Подобным образом рассчитан коэффициент для крупного рогатого скота.

 

 

 

 

 

ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ ГЕМОГЛОБИНЦИАНИДНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ

МЕТГЕМОГЛОБИНА КРОВИ ЖИВОТНЫХ, В ТОМ ЧИСЛЕ ПТИЦЫ

 

Метод предназначен для химико-токсикологических, клинических и других исследований свернувшейся (сгустков) и несвернувшейся (цельной) крови на долю метгемоглобина в процентах по отношению к общему гемоглобину.

Методы основаны на уменьшении величины оптической плотности содержащегося в исследуемом растворе крови метгемоглобина (гемоглобина) вследствие перевода его в цианметгемоглобин (гемоглобинцианид) и вычисления процентного соотношения этой величины к такому же показателю 100-процентного метгемоглобина того же раствора крови.

    Принцип  определения  -  фотоколориметрический  по  прямому определению

                                                            630

(установлению) величины уменьшения оптической плотности (Д ДЕЛЬТА) раствора

крови в одной кювете.

Погрешность метода - не более 0,075% при нормальном и 0,227% при 71,1-процентном содержании метгемоглобина от общего гемоглобина.

Выявляемость метода при оптической плотности 0,001 составляет не более 0,3%.

 

1. Оборудование, реактивы и растворы

 

1.1. Оборудование:

колориметр-нефелометр фотоэлектрический типа ФЭК-56 М или другие приборы подобного типа с наличием светофильтра с длиной волны 625 - 670 нм;

центрифуга лабораторная на 4 - 8 тыс. об./мин. типа ЦЛН-2 или ЦУМ-1 и др.;

колбы мерные вместимостью 25 куб. см;

пипетки на 1, 5 и 10 куб. см;

стаканчики стеклянные на 50 куб. см;

пипетки глазные;

палочки стеклянные или пластмассовые.

1.2. Реактивы и растворы:

ацетонциангидрин по ТУ 6-09-3558-81 или ГОСТ 13198-77, 10-процентный раствор (объем/объем). Годен до 1 года;

вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72;

калий железосинеродистый (соль красная кровяная) по ГОСТ 4206-75, х.ч., 10-процентный раствор. Годен 30 дней при хранении в темном месте.

 

2. Подготовка к анализу

 

2.1. Приготовление раствора крови.

2.1.1. Из сгустка крови. От свежего трупа животного (в том числе птицы) или из патматериала (из сердца, крупных сосудов) берут в стаканчик сгусток крови массой около 1 г, добавляют 9 куб. см воды и сгусток тщательно разминают чистым никелированным пинцетом до обесцвечивания комков фибрина. Затем комки фибрина удаляют, а в стаканчик с гемолизатом эритроцитов приливают 15 куб. см воды.

2.1.2. Из цельной крови. В мерную колбу на 25 куб. см наливают около 20 куб. см воды, 1 куб. см (точно) гепаринизированной (декальцинированной трилоном Б или оксалатной) крови, промывают внутренний канал пипетки несколько раз содержимым колбы (избегая образования пены), объем гемолизата эритроцитов в колбе доводят водой до метки и тщательно перемешивают (разведение крови в 25 раз).

2.1.3. Гемолизаты из стабилизированной крови или сгустка крови переносят в капроновые центрифужные патроны, центрифугируют 15 - 20 мин. при 8 тыс. об./мин. и исследуют не позднее 1 ч после центрифугирования.

 

3. Проведение анализа

 

3.1. Устанавливают в рабочее положение светофильтр с длиной волны 630 нм. В левый кюветодержатель помещают 10-миллиметровую кювету с водой, а в правый - такую же кювету с 4 куб. см центрифугата раствора крови и устанавливают правый измерительный барабан прибора точно на ноль (по красной шкале). Открывают световое окно с помощью рукоятки шторки и вращением левого барабана добиваются установки стрелки микроамперметра на ноль.

    В кювету с раствором крови вносят одну каплю раствора ацетонциангидрина

(АЦГ)  и  перемешивают  содержимое  кюветы  стеклянной  палочкой.  При этом

взаимодействие  метгемоглобина  с  АЦГ  с  образованием  цианметгемоглобина

заканчивается  через 2 - 3 мин. Через 2 - 3 мин. после прибавления раствора

АЦГ  открывают  световое  окно  прибора  и  правым  измерительным барабаном

устанавливают  стрелку  микроамперметра  на  ноль. По красной шкале правого

                                                                     630

барабана отсчитывают показатель уменьшения оптической плотности (Д  ДЕЛЬТА)

                                                                  1

раствора крови.

3.2. Правую кювету освобождают от содержимого и 4 - 5 раз тщательно промывают водой. Затем ополаскивают кювету 0,5 куб. см раствора крови, наливают 4 куб. см того же раствора крови и устанавливают кювету в правый кюветодержатель. К раствору крови в кювете добавляют одну каплю 10-процентного раствора красной кровяной соли (ККС), перемешивают другой чистой стеклянной палочкой и оставляют стоять 3 мин. За это время весь кровяной пигмент превращается в метгемоглобин.

Устанавливают правый измерительный барабан точно на ноль, а левый (не открывая светового окна) устанавливают на отметку 0,4 - 0,6 по красной шкале. Открывают шторку светового окна и левым барабаном точно устанавливают стрелку микроамперметра на ноль.

К раствору крови в кювете прибавляют одну каплю раствора АЦГ, содержимое кюветы перемешивают стеклянной палочкой, устанавливают первый барабан на отметку 0,4 (грубая наводка, без открытия светового окна).

    Через 2 - 3 мин. после прибавления раствора АЦГ открывают световое окно

и  устанавливают  правым измерительным барабаном стрелку микроамперметра на

ноль.  По  красной  шкале  правого  барабана  снимают показатель уменьшения

                           630

оптической  плотности (Д  ДЕЛЬТА) раствора крови, в котором весь гемоглобин

                        2

был переведен в метгемоглобин.

 

4. Обработка результатов

 

4.1. Долю метгемоглобина (в %) к общему гемоглобину (общему пигменту) крови вычисляют по формуле:

 

                                     630

                                 Д  ДЕЛЬТА х 100

                                  1

                         MetHb = ---------------,

                                        630

                                    Д  ДЕЛЬТА

                                     2

 

    где:

        630

    Д  ДЕЛЬТА - показатель  уменьшения  оптической плотности раствора крови

     1

после прибавления АЦГ;

        630

    Д  ДЕЛЬТА - показатель  уменьшения оптической плотности 100-процентного

     2

метгемоглобинового раствора крови после прибавления АЦГ.

 

5. Оценка результатов

 

5.1. Для постановки диагноза при отравлении животных и птицы метгемоглобинобразующими ядами определение доли метгемоглобина к общему гемоглобину является решающим диагностическим показателем.

Обнаружение в крови более 30% метгемоглобина указывает на возможность отравления, а более 60% - на возможную причину падежа животного от отравления метгемоглобинобразующими веществами (ядами).

5.2. Обнаружение в крови животного нормального содержания (до 5%) метгемоглобина исключает потребность проведения химико-токсикологических исследований патматериала на метгемоглобинобразующие вещества (нитриты, бертолетову соль, красную кровяную соль, анилин и др.). Однако для исключения отравления животных нитрат-ионами (без их редукции в нитриты) необходимо патматериал исследовать на нитраты.