Утверждены
Минздравом СССР
6 августа 1981 г. N 2431-81
21 ноября 1985 г. N 4039-85
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ КАРТОЦИДА (ФИТОНА) В КАРТОФЕЛЕ, СВЕКЛЕ,
ОГУРЦАХ, ТОМАТАХ, ЯБЛОКАХ, ЦИТРУСОВЫХ,
ЛУКЕ, ЖОМЕ,
МЕЛАССЕ, САХАРЕ, ВОДЕ И БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
--------------------------------
<*> Разработаны
Т.В. Алдошиной, К.Ф. Новиковой, Ф.Г. Мельцер, Г.А. Летуновской, Э.В. Сазоновой
(ВНИИХСЗР).
Краткая
характеристика препарата. Картоцид
- новый отечественный
фунгицид, рекомендуемый
для борьбы с грибковыми
заболеваниями картофеля,
томатов и других
сельскохозяйственных культур. Действующее начало препарата
- трикапролактамо-медь (II)-дихлоридмоногидрат. Брутто-формула
C H Cl N
O Cu. Молекулярная масса 482,0. В чистом
виде кристаллы желтого
18 35 2
3 4
цвета, т.
пл. 83 -
85 °C. Хорошо
растворимы в воде. Растворимость в
органических растворителях при 20 °C, %: в ксилоле - 1,8, хлороформе -
4,4,
ацетоне - 12,7, этиловом спирте - 21,5. Давление паров при
20 °C 0,04 Па. В
лимонах МДУ 0,1
мг/кг. В сахарной свекле, цитрусовых (мякоть)
содержание
картоцида не
допускается.
Принцип метода. Метод основан на извлечении
картоцида из сельскохозяйственной продукции ацетоном, очистке экстракта
перераспределением из ацетоновой среды в хлороформ, а затем на колонке с окисью
алюминия с последующим определением образовавшегося капролактама методом ТСХ на
пластинках "Силуфол". Из воды картоцид извлекают хлороформом и без
очистки экстракта определяют методом ТСХ. В биологических объектах картоцид
гидролизуют 0,1 н HCl до капролактама с последующим распределением его в
хлороформ, очистке экстракта на колонке с оксидом алюминия и определением
методом ТСХ.
Метрологическая характеристика метода.
Предел обнаружения в
хроматографируемой пробе
3 мкг. Предел определения в сельскохозяйственной
продукции 0,15
мг/кг, в воде 0,001 мг/л, в жоме
0,3 мг/кг и в мелассе
0,6 мг/кг.
Среднее значение определения стандартных
количеств картоцида
_
c 80% при n =
15. Стандартное отклонение +/- 8,0%.
Доверительный интервал
среднего при p
= 0,95, n = 5 для
всех объектов 80,0 +/- 10,3%.
Размах
варьирования для
всех объектов 72,0 - 85,0%. Метрологическая характеристика
метода дана в
таблице 127.
Таблица 127
МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА
ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРТОЦИДА В БИООБЪЕКТАХ
┌──────────┬────────────┬──────────────┬───────────┬─────────────┬────────┐
│Анализи- │ Нижний
│ Среднее │Стандартное│Доверительный│Размах │
│руемый │
предел │ значение
│отклонение │
интервал │варьиро-│
│объект │определения,│ _ │при n = 15,│
определения │вания, %│
│ │ мкг/г │определения c │ %
│ при n = 5, │ │
│ │ или мкг/мл │при n = 15,
% │ │ p = 0,95, % │ │
├──────────┼────────────┼──────────────┼───────────┼─────────────┼────────┤
│Моча │5 │87,3 │+/- 8,0 │87,3 +/- 9,9 │80 - 100│
│Кровь │5 │76,7 │+/- 8,2 │76,7 +/- 10,2│70 - 90 │
│Почки │1,5 │56,0 │+/- 5,5 │55,0 +/- 6,8 │50 - 60 │
│Печень │0,7 │56,0 │+/- 5,6 │55,0 +/- 7,0 │50 - 60 │
└──────────┴────────────┴──────────────┴───────────┴─────────────┴────────┘
Избирательность метода. Прочие пестициды
определению не мешают, так как проявление на пластинке селективно лишь для
картоцида.
Реактивы и материалы. Ацетон
х.ч. Гексан х.ч. Хлороформ х.ч. Бензол х.ч. Метиловый спирт х.ч. Этиловый спирт
х.ч. Сульфат натрия безводный х.ч. Хлороводородная кислота, х.ч. 2 н и 0,1 н.
Гидроксид натрия 1 н и 4 н. Хлорид железа ч.д.а. Гидроксиламин солянокислый
ч.д.а. Проявляющие реагенты: N 1 (растворяют 21 г гидроксиламина
солянокислого в 100 мл воды. Перед обработкой
хроматограммы смешивают 20 мл полученного раствора с 5 мл 1 н NaOH); N 2 (к 85
мл воды добавляют 15 мл 2 н HCl и растворяют 10 г хлорида железа).
Пластинка "Силуфол". Оксид алюминия нейтральный, II степени
активности или отечественный для хроматографии. Стандартные растворы картоцида
в ацетоне с содержанием 100 мкг/мл (раствор 1) и 10 мкг/мл (раствор 2).
Растворы 1 и 2 стабильны при хранении в холодильнике в течение 3 мес.
Приборы, аппаратура, посуда. Ротационный
вакуумный испаритель. Аппарат для встряхивания. Камера для хроматографирования.
Делительные воронки на 25; 100 и 1500 мл. Колбы: плоскодонные на 50 и 250 мл;
круглодонные на 250 мл; мерные на 100 мл; конические на 25; 50 и 100 мл. Хроматографические
колонки длиной 10 см, внутренним диаметром 2,5 см (колонка N 1) и 0,8 см
(колонка N 2) с краном, стеклянная. Пробирки конические градуированные на 10
мл. Пипетки на 1; 5 и 10 мл с делениями. Пульверизаторы стеклянные. Цилиндры
мерные на 100 и 250 мл. Пористый фильтр. Пипетки на 1 и 10 мл с делениями.
Сушильный шкаф.
Подготовка к определению
хроматографических камер. Хроматографические камеры за 1 ч до начала
хроматографирования заполняют смесью подвижных растворителей хлороформ-метиловый
спирт (25:2) и бензол-этиловый спирт (30:5) для насыщения камер парами
подвижных растворителей. Объем подвижного растворителя должен по высоте
находиться не ниже 0,7 - 1,0 см от уровня дна камеры. Хроматографическую
колонку N 1 заполняют 3,5 г оксида алюминия в 20 мл хлороформа. Избыток
хлороформа сливают с подсоединением слабого вакуума, оставляя слой растворителя
на уровне 1 - 2 мм над поверхностью сорбента. Хроматографическую колонку N 2
заполняют 2 г оксида алюминия в 15 мл хлороформа при анализе мочи и крови и 9 г
оксида алюминия в 40 мл при анализе печени и почек. Избыток хлороформа сливают
с подсоединением слабого вакуума, оставляя слой растворителя на уровне 1 - 2 мм
над поверхностью сорбента.
Подготовка проб к анализу. Для анализа
картофеля, огурцов, яблок, цитрусовых, лука, свеклы из средней пробы
подготавливают три параллельные навески массой 20 г. Картофель, огурцы, свеклу,
цитрусовые, яблоки измельчают ножом на кубики с размером граней около 0,5 см.
Томаты и лук измельчают на маленькие дольки. Сахар анализируют в виде песка или
молотого сахара и отбирают три параллельные навески массой 20 г, жом
анализируют в естественном виде, отбирая навески массой 10 г. Каждую отобранную
пробу крови (2 мл) или мочи (2 мл) помещают в отдельную пробирку и анализируют
всю отобранную пробу. Навеску почек берут 5 - 10 г, печени 10 - 15 г.
Ход анализа. Экстракция
и очистка экстракта. Навеску
анализируемой
пробы
картофеля, огурцов, томатов, яблок, цитрусовых, свеклы, лука,
жома,
сахара помещают в плоскодонную колбу на 500 мл, заливают 40 мл ацетона и
экстрагируют картоцид с помощью механического встряхивания
колбы в течение
30 мин. Экстракт
пропускают через бумажный фильтр в круглодонную колбу на
250 мл, содержащую 0,5 мл воды. Экстракцию овощей и фруктов проводят еще 2
раза тем же
количеством растворителя. Из
объединенного экстракта с помощью
ротационного вакуумного
испарителя отгоняют ацетон.
Водный остаток
переносят в
делительную воронку на 100 мл. Колбы
ополаскивают 2 раза водой
общим объемом
5 мл, в случае жома и сахара - 20 - 25 мл. Водный
раствор
дважды промывают
10 мл гексана. Гексановый слой отбрасывают. Из водной фазы
картоцид трижды
экстрагируют хлороформом порциями
по 10 мл.
После
разделения слоев
хлороформный слой переносят в коническую
колбу на 100 мл,
сушат над
безводным сульфатом натрия (7 - 10 г), фильтруют в круглодонную
колбу на 50
мл. Из
круглодонной колбы с помощью ротационного
вакуумного
испарителя отгоняют
растворитель до объема 1 мл. Остаток
переносят на
хроматографическую колонку
1, заполненную оксидом
алюминия II степени
активности в
хлороформе, при закрытом кране колонки, открывают кран колонки
и дают
раствору впитаться в
сорбент. Колбу дважды обмывают хлороформом
порциями по 2
мл и
полученный раствор каждый раз переносят на колонку и
элюируют картоцид
с колонки 30 мл
хлороформа со скоростью 30 кап./мин.
Элюат собирают
в коническую пробирку.
Общий объем элюата 25 - 30 мл.
В пробирку помещают
стеклянный капилляр с
заплавленным верхним концом и
удаляют
растворитель на горячей водяной бане до объема ~ 0,05 мл. Остаток с
помощью того же
капилляра, но с отломленным заплавленным концом переносят
на
хроматографическую пластинку. Параллельно на пластинку наносят
серию
стандартов с
содержанием картоцида 3 - 15 мкг.
Хроматограмму развивают в
системе хлороформ-метанол (25:2)
или бензол-этанол (30:5).
После
развития хроматограммы пластинку
сушат, а затем
обрабатывают из
пульверизатора
проявляющим раствором N 1. Влажную хроматограмму выдерживают
в сушильном
шкафу при 120 °C в течение 15 - 20 мин., а затем обрабатывают
раствором N
2. Картоцид в виде капролактама
проявляется на пластинках в
виде темно-коричневых пятен
на желтом фоне с R 0,40 +/- 0,05 в первой
f
системе и 0,28
+/- 0,03 во второй. Пятна стабильны в течение 5 - 7 мин.
Навеску мелассы 5 г растворяют в 100 мл
дистиллированной воды и трижды экстрагируют в делительной воронке на 500 мл
хлороформом порциями по 100 мл. Объединенный хлороформный экстракт сушат над
безводным сульфатом натрия (25 г), затем фильтруют в круглодонную колбу,
содержащую 0,5 мл 0,1 н HCl, и полностью отгоняют растворитель с помощью
ротационного вакуумного испарителя. Влажный остаток количественно переносят из
колбы в делительную воронку на 100 мл 25 мл 0,1 н HCl и трижды экстрагируют
хлороформом порциями по 10 мл. Объединенный хлороформный экстракт сушат над
безводным сульфатом натрия (5 г). Далее поступают, как описано для другой
сельскохозяйственной продукции.
Из 1 л воды картоцид извлекают 4-кратной
экстракцией хлороформом порциями по 100 мл, в делительной воронке - по 1,5 л. В
воду предварительно добавляют около 15 г NaCl. Объединенный хлороформный
экстракт сушат над безводным сульфатом натрия и порциями фильтруют в
грушевидную колбу на 50 мл. Из колбы с помощью ротационного вакуумного
испарителя отгоняют растворитель до объема 1 - 2 мл. Последнюю порцию
хлороформа отгоняют до объема 0,1 мл. Остаток количественно с помощью
стеклянного капилляра переносят на хроматографическую пластинку, далее
поступают так, как описано для анализа растительных проб.
Образец крови или мочи
переносят в делительную
воронку вместимостью
25 мл, пробирку
обмывают 1 - 2 мл 0,1 н
соляной кислоты и полученный
раствор также
переносят в делительную
воронку. Содержимое делительной
воронки доводят
до 10 мл
0,1 н хлороводородной кислотой,
смесь
перемешивают
несколько секунд и трижды экстрагируют полученный капролактам
хлороформом
порциями по 10 мл. Хлороформный экстракт в плоскодонной
колбе
на 50 мл сушат
над безводным сульфатом натрия (5 г). Хлороформный раствор
порциями декантируют
в круглодонную колбу
на 25 мл, а затем с помощью
ротационного
вакуумного испарителя концентрируют до объема ~ 1 мл. Сульфат
натрия в
колбе 3 раза промывают свежими порциями хлороформа по 2 - 3 мл,
полученный раствор
также переносят в круглодонную
колбу и каждую порцию
концентрируют до
объема ~ 1 мл.
Остаток в колбе
переносят на
хроматографическую колонку II с
Al O при закрытом кране. Открывают кран
2 3
колонки и дают
раствору впитаться в сорбент. Колбу несколько раз обмывают
хлороформом и
полученный раствор каждый раз переносят на колонку. Элюируют
капролактам с
колонки хлороформом со скоростью 2
кап./с с подсоединением
слабого вакуума.
Общий объем элюата 15 мл. Собирают элюат в грушевидную
колбу на 25
мл с
оттянутым концом. Полученный раствор концентрируют с
помощью ротационного
вакуумного испарителя до объема
0,05 мл и проводят
определение
методом ТСХ.
Навеску почек (5 - 10 г) гомогенизируют с
помощью ножа до состояния кашицы, добавляют 20 мл 0,1 н HCl. Гомогенизат
перемешивают с кислотой в течение нескольких минут. Полученную массу фильтруют
через пористый фильтр (пор 160) с подсоединением слабого вакуума. Остаток на
фильтре промывают 0,1 н соляной кислотой порциями по 5 мл 4 раза. Фильтрат
переносят в делительную воронку на 100 мл и трижды экстрагируют капролактам
хлороформом порциями по 10 мл. Хлороформный экстракт сушат над безводным
сульфитом натрия (5 г), а затем декантируют раствор в грушевидную колбу на 50
мл. Остаток в колбе промывают несколько раз хлороформом общим объемом 10 мл.
Хлороформный экстракт концентрируют с помощью ротационного вакуумного
испарителя до объема ~ 1 мл. Остаток в колбе переносят на хроматографическую
колонку II с оксидом алюминия при закрытом кране. Открывают кран колонки и дают
раствору впитаться в сорбент. Колбу несколько раз обмывают хлороформом порциями
по 1 мл и полученный раствор каждый раз переносят на колонку, элюируют
капролактам с колонки хлороформом со скоростью 2 кап./с с
подсоединением слабого вакуума. Общий объем элюата 40 мл. Элюат собирают в
грушевидную колбу на 50 мл с втянутым концом. Полученный раствор концентрируют
с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема ~ 0,05 мл и проводят
определение методом ТСХ.
Навеску печени (10 - 15 г) гомогенизируют
с помощью ножа до состояния кашицы, добавляют 35 мл 0,1 н HCl. Гомогенизат
перемешивают с кислотой в течение нескольких минут. Полученную массу фильтруют
через пористый фильтр (пор 160) с подсоединением слабого вакуума. Остаток на
фильтре промывают 0,1 н хлороводородной кислотой порциями по 5 мл 4 раза.
Фильтрат переносят в делительную воронку на 100 мл и экстрагируют капролактам
трижды хлороформом порциями по 15 мл. Хлороформный экстракт сушат над безводным
сульфатом натрия (5 - 7 г), а затем декантируют раствор в грушевидную колбу на
50 мл. Содержимое колбы концентрируют с помощью ротационного вакуумного
испарителя до объема 2 - 3 мл. Оставшийся в колбе сульфат натрия промывают
несколько раз хлороформом общим объемом 10 мл. Хлороформный раствор переносят в
грушевидную колбу и ее содержимое концентрируют до
объема 1 мл. Остаток переносят на хроматографическую колонку II и далее
поступают так, как описано выше при анализе почек.
Обработка результатов анализа.
Количественное определение проводят путем сравнения площади и интенсивности
пятен рабочей пробы и серии стандартов. При большом содержании картоцида на
пластинку наносят аликвотную часть раствора. Содержание картоцида в
анализируемой пробе (X, мг/кг или мг/л) вычисляют по формуле:
AV
2
X = ---,
V P
1
где:
A - количество картоцида, найденное в
хроматографируемой пробе, мкг;
V -
общий объем раствора, мл;
2
V -
объем аликвоты, отобранной
для хроматографирования, мл (при
1
нанесении всей
пробы V = V );
1 2
P - навеска пробы или объем анализируемой
пробы воды, г или мл.
Требования безопасности. Соблюдать
требования техники безопасности, установленные для работы с
легковоспламеняющимися жидкостями и метиловым спиртом.