Утверждаю
Заместитель министра
здравоохранения РСФСР
К.И.АКУЛОВ
22 мая 1985 г. N 05РП-12-2396
Согласовано
Заместитель начальника
Главного управления НИИ
и координации научных
исследований
В.П.ЛАПШИН
3 апреля 1985 года
ПРОВЕДЕНИЕ САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
ПРОДУКЦИИ ДЕТСКИХ МОЛОЧНЫХ КУХОНЬ
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Настоящие "Методические
рекомендации" представляют собой переиздание в соответствии с современным
уровнем знаний "Методических рекомендаций по санитарно-бактериологическому
исследованию продукции молочных кухонь", утвержденных ГСЭУ МЗ РСФСР
16.09.63.
Методические рекомендации подготовлены
отделом гигиены питания Минздрава РСФСР, Республиканской санэпидстанцией
Минздрава РСФСР, Московской городской санэпидстанцией и одобрены Лабораторным
Советом при ГСЭУ Минздрава РСФСР.
1. ВВЕДЕНИЕ
Методические рекомендации предназначены
для специалистов бактериологической лаборатории и санитарных врачей
санитарно-эпидемиологических станций, осуществляющих текущий надзор за
качеством готовой продукции детских молочных кухонь. Последние
вырабатывают продукцию для питания детей раннего возраста (до 1 года), которая
должна обеспечивать гигиеническую надежность, эпидемиологическую безопасность,
высокую пищевую и биологическую ценность. Это достигается строгим
соблюдением санитарно-гигиенических условий приготовления, хранения и
реализации детских молочных смесей, что в свою очередь исключает возможность
размножения оставшейся микрофлоры и вторичного обсеменения готовой продукции.
Систематический лабораторный контроль за качеством
сырья, готовой продукции, санитарно-гигиенического состояния производства
(качества мойки и дезинфекции оборудования и инвентаря, соблюдение правил
личной гигиены работниками) позволяет объективно установить санитарное
содержание обследуемых молочных кухонь, раздаточных пунктов и провести
мероприятия по улучшению санитарного режима.
При организации
контроля следует руководствоваться Санитарными правилами для детских молочных
кухонь, утвержденными Минздравом СССР 22.11.72, N 997-72, Инструкцией по
приготовлению молочных и других смесей на детских молочных кухнях системы
здравоохранения, утвержденной Минздравом СССР 13.04.80, N 08-14/3-14, Приказом
Минздрава СССР от 17.05.78 N 473 "О частичном изменении Инструкции по
приготовлению молочных и других детских смесей". При этом необходимо обращать особое внимание на следующие положения:
- молоко, доставленное из хозяйства по
прямым связям или с молочных заводов, должно быть натуральным или
нормализованным;
- помещение для изготовления молочной
закваски должно быть изолировано и оборудовано холодильным шкафом или камерой
для хранения кефирных грибов и молочных заквасок. Молочные закваски, так же как
и кефирные закваски, должны регулярно подвергаться химикобактериологическим
анализам;
- на каждой порции продукции должна быть
этикетка с указанием вида, количества продукции, даты и часа приготовления;
- срок хранения готовой продукции не
более 1 суток после окончания технологического процесса;
- продукцию молочных кухонь необходимо
доставлять на раздаточные пункты на специально оборудованном транспорте;
- раздаточный пункт следует оборудовать
достаточным количеством холодильного оборудования.
2.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ
Для оценки продукции детских молочных
кухонь необходимо проводить: определение общего количества бактерий в 1 куб.
см, титра группы кишечных палочек, бактериоскопию кисломолочной продукции,
исследование на Staphyl. aureus
в 1,0 г/куб. см продукта, и руководствоваться следующими показателями:
2.1. В пастеризованных и вареных смесях:
2.1.1. Общее микробное обсеменение в 1
г/куб. см продукта не должно превышать 500.
2.1.2. Титр бактерий группы кишечных
палочек более 11,1.
2.2. В кисломолочных продуктах:
2.2.1. Результаты бактериоскопического
исследования препарата должны характеризовать данный продукт вносимым в него в
качестве закваски определенным составом молочнокислой микрофлоры;
2.2.2. Титр бактерий группы кишечных
палочек более 11,1;
2.2.3. Staphylococcus
aureus должен отсутствовать в 1,0 г/куб. см
исследуемого продукта.
3. ПОРЯДОК
ПРОВЕДЕНИЯ САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО
ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОДУКЦИИ ДЕТСКИХ МОЛОЧНЫХ КУХОНЬ
3.1. Подготовка
проб пищевых продуктов к исследованию
Перед посевом жидкие и полужидкие
продукты тщательно перемешивают, определяют рН и в случае рН ниже 7,0 - 7,2
подщелачивают 10% стерильным раствором соды до нейтральной реакции.
Творог, как продукт плотной консистенции,
подготавливают к посеву следующим образом.
Перед началом исследования навеску 12 г
творога, взятого стерильным или фламбированным
скальпелем из 2 - 3 мест пробы творога, тщательно растирают в гомогенизаторе
или стерильной фарфоровой ступке с песком пестиком с постепенным добавлением
108 мл стерильного физиологического раствора хлорида натрия или 0,1% пептонной воды, подогретой до 45 °С,
и сливают в стерильную банку. Если приготовленная взвесь имеет низкий рН, то производят подщелачивание, как указано выше.
3.2. Метод
определения количества мезофильных аэробных
и факультативно анаэробных микроорганизмов в 1 г
продукта
Сущность метода
заключается в выявлении способности мезофильных
аэробов и факультативных анаэробов расти на питательном агаре
при температуре (37° +/- 0,5°) с образованием колоний, видимых при увеличении в
5 раз.
Из каждой пробы должно быть сделано не
менее двух посевов, различных по объему, взятых с таким расчетом, чтобы на
чашках вырастало от 30 до 300 колоний.
Засевают глубинным методом по 1,0 куб. см
из 1 и 2 разведений, что составляет 0,1 и 0,01 куб. см/г
продукта соответственно.
Для посева 0,1 г продукта из взвеси
(первого десятикратного разведения) стерильной пипеткой с широким концом
отбирают 1 куб. см испытуемой взвеси или 0,1 куб. см жидкого продукта и
переносят в стерильную чашку Петри, слегка приоткрывая крышку.
Для посева 0,01 г продукта готовят
следующее разведение: новой стерильной пипеткой, после тщательного
перемешивания содержимого банки, берут 1 куб. см и переносят в пробирку с 9
куб. см физиологического раствора хлорида натрия или 0,1% пептонной
воды.
1 куб. см этого раствора переносят в
стерильную чашку Петри, как описано выше. При необходимости таким же образом
готовят следующие разведения.
После внесения анализируемой взвеси чашку
Петри заливают 12 - 15 куб. см расплавленного и охлажденного до 45°
питательного агара при фламбировании
краев пробирки, где он содержится.
Быстро смешивают с питательным
агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по
поверхности стола. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, незалитых участков дна чашки Петри и попадания следа на
края и крышку чашки.
После застывания агара
чашки Петри перевертывают и помещают в термостат с температурой 37 °С на 48 часов. Через 48 часов подсчитывают общее
количество колоний бактерий, выросших на чашках.
Колонии, выросшие как на поверхности, так
и в глубине агара, подсчитывают при помощи лупы с
пятикратным увеличением или специальным прибором с лупой. Для этого чашку
кладут вверх дном на черный фон и каждую колонию отмечают со стороны дна тушью
или чернилами для стекла.
ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
Для определения общего количества
микробов в 1 г продукта подсчитанное количество колоний умножают на степень
разведения анализируемого продукта.
За окончательный результат определения
количества бактерий в 1 г анализируемого продукта следует принимать количество
колоний, выросших из первого разведения. В случае роста большого количества
колоний при посеве 1 и 2 разведения используют среднее арифметическое
результатов подсчета двух чашек разной массы продукта.
3.3. Метод
определения титра бактерий группы
кишечных палочек
При определении титра бактерий группы
кишечных палочек производят посевы на среду Кесслер
следующих объемов:
3.3.1. Неразведенные продукты в
количестве 10,0 куб. см/г в 50,0 мл среды, а 1,0 куб.
см/г в 10,0 мл среды. Количества 0,1 и 0,01 куб. см/г
засевают в 5,0 куб. см среды (из десятикратно убывающих разведений по 1,0 куб.
см каждого).
Посевы помещают в термостат на 18 - 24
часа при 43°.
3.3.2. Через 18 - 24 часа из всех посевов
на среде Кесслер производят высевы на сектора чашки
со средой Эндо (Левина) и помещают при 37° на 18 - 24
часа.
3.3.3. При наличии на среде Эндо (Левина) колоний, типичных для бактерий группы
кишечных палочек (красных с металлическим блеском и без блеска, слизистых,
розовых, а также бесцветных), их изучают, в препаратах окрашенных по Граму - микроскопируют.
3.3.4. Колонии грамотрицательных палочек
высевают на пептонную среду с глюкозой и помещают в
термостат на 18 - 24 часа при 31 +/- 0,5 °С. Бесцветные лактозоотрицательные
колонии высевают на среду Ресселя или Олькеницкого и выращивают при 37 °С 24 часа для их
дальнейшей идентификации. Высевы со среды Эндо на
жидкую пептонную среду с глюкозой производят не менее
чем с двух наименьших объемов (секторов).
3.3.5. Обнаружение кислоты и газа в пептонной среде с глюкозой указывает на наличие бактерий
группы кишечных палочек в том или ином количестве засеянного продукта
<*>.
--------------------------------
<*> Определение коли-титра
производится по таблице (см. Приложение N 2).
Обнаружение грамотрицательных палочек, не
сбраживающих лактозу при 37°, проверяют на образование индола, сбраживание
сахарозы и по ряду других тестов во избежание пропуска патогенных
представителей семейства кишечных в соответствии с "Методическими
указаниями по микробиологической диагностике заболеваний, вызванных энтеробактериями", утв. Минздравом СССР 19.12.84.
Примечание:
1. В случае повторяющихся результатов с
неудовлетворительным титром бактерий группы кишечных палочек в исследуемых
продуктах следует произвести повторную выемку проб с этого же объекта. Колонии,
выросшие на среде Эндо, необходимо дополнительно
исследовать на наличие энтеропатогенных кишечных
палочек согласно принятым методикам.
2. Для ускорения анализа целесообразно
отсевать колонии в пробирки с небольшим количеством пептонной
среды с глюкозой (1,5 - 2 мл), предварительно подогретой в термостате при 43
°C. При этих условиях результаты на жидкой пептонной
среде могут быть учтены через 3 - 5 часов.
3.4. Бактериоскопическое исследование
Вследствие того, что в кисломолочные
продукты вводится специфическая микрофлора, определяющая органолептические
(вкус, запах) и питательные свойства продукта, определение общего числа
бактерий не производится. Каждый кисломолочный продукт имеет свой микробный
пейзаж, т.е. определенный состав микрофлоры с довольно постоянным
количественным соотношением молочнокислых микроорганизмов.
Кефирная закваска готовится на кефирных
грибках, которые представляют симбиоз молочнокислых стрептококков,
молочнокислых палочек и дрожжевых клеток. Поэтому в препарате, приготовленном
из кефира (кефир сквашивается бактериальной закваской, приготовленной на
кефирных грибках), должны обнаруживаться молочнокислые стрептококки, нередко
распадающиеся на диплококки, в небольшом количестве молочнокислые палочки и
обязательно единичные дрожжевые клетки.
Для изготовления творога применяют
закваску из молочнокислых стрептококков или, если ее нет, допускают кефирную
закваску. Поэтому при бактериоскопии творога в поле зрения микроскопа могут
находиться молочнокислые стрептококки, как правило, распавшиеся на диплококки
(если применялась молочнокислая закваска), если же применялась кефирная
закваска, то в поле зрения будут, кроме того, молочнокислые палочки и единичные
дрожжевые клетки. Большое количество дрожжевых клеток свидетельствуют о
процессе брожения, вызывающего изменения органолептических свойств и ухудшение
качества творога.
Закваска для простокваши и пахтанье
готовится из чистых культур молочнокислых стрептококков и болгарской или
ацидофильной палочки. В препаратах из такой закваски, а также в препаратах
простокваши и пахтанье, в которые была внесена эта закваска, в поле зрения
микроскопа при бактериоскопии должны находиться указанные микроорганизмы.
Результаты бактериоскопии позволяют на
основании общего микробного пейзажа дать заключение о чистоте применяемой
закваски и обнаружить случайную микрофлору, которая в большом количестве
нарушает органолептические свойства и вызывает порчу продуктов, как, например,
молочная плесень (оидии, гифы) или дрожжевые клетки,
обнаруженные в большом количестве в твороге и простокваше.
Наличие большого количества лейкоцитов
свидетельствует о воспалительном процессе вымени коровы, от которой взято
молоко.
Приготовление препарата для
бактериоскопии.
1. Для получения препарата неразведенный
кисломолочный продукт наносят тонким слоем на предметное стекло. Материал
рекомендуется брать пипеткой из глубины исследуемого образца, особенно при
исследовании кефира, т.к. дрожжевые клетки обычно оседают на дно.
2. Препарат подсушивают, фламбируют и окрашивают 1-процентным водным раствором метиленового синего.
3.5. Методика
выделения и идентификации микроорганизмов
рода Staphylococcus aureus
1 этап. Посев производят в количестве 1
г/куб. см в пробирки с содержанием 6,5% солевого бульона в количестве 10 куб.
см. Посевы инкубируются при +37 °С в течение 18 - 24
часов.
2 этап. Из сред обогащения производят
высевы на сектора с молочным агаром
или желточным агаром (ЖА) без добавления NaCl. Все посевы инкубируют при 37 °C в течение 18 - 24
часов.
Примечание:
1. На средах, содержащих желток,
стафилококки, выделенные от человека, образуют в 60 - 70% культур радужный
венчик вокруг культур - положительная лецитовителлазная
реакция. Стафилококки животного происхождения дают положительную лецитовителлазную реакцию 5 - 10% культур.
2. На чашках с молочным агаром у стафилококков на
2 день при комнатной температуре учитывают пигментообразование.
3 этап. Просматривают посевы на молочном
и желточном агаре (МА, ЖА). На ЖА колонии
стафилококков дают радужный венчик, на МА образуют пигмент золотистый,
лимонно-желтый и др.
Изолированные
колонии, подозрительные на стафилококки, изучают, микроскопируют
с окраской по Граму и высевают на скошенный агар или сектора с МА. Число
колоний, взятых для идентификации, должно быть не менее 5 - 7.
4 этап. Выделенную
чистую культуру с секторов на чашках с молочным или из пробирок со скошенным
питательным агаром подвергают микроскопии с окраской
по Граму. При наличии мелких грамположительных
кокков ставят реакцию плазмокоагуляции на ферментацию
маннита и с учетом результатов первичных посевов на лецитовителлазную активность. Делают заключение о
принадлежности выделенной культуры к Staphylococcus aureus.
Реакция плазмокоагуляции.
Наилучшим методом предварительной
идентификации Staphyl. aureus
в лабораторных условиях является коагулазная проба в
стерильной пробирке, закрытой ватной пробкой, с кроличьей плазмой. При чтении
реакции плазмокоагуляции установлено три градации
активности фермента коагулазы.
1. +++ - сгусток плотный;
2. +++ - сгусток, имеющий небольшой
отсек;
3. ++ - сгусток в виде взвешенного
мешочка.
Эту реакцию следует читать очень
осторожно, не встряхивая, чтобы не повредить и не нарушить образования сгустка.
Постановка реакции: 1. В
пробирку с 0,5 куб. см цитратной плазмы, разведенной изотоническим раствором
хлорида натрия в соотношении 1:4, вносят петлю суточной чистой культуры
стафилококка и ставят в термостат при 37 °С. Осторожно просматривают реакцию плазмокоагуляции через 30 минут, 1 час, 2 - 6 часов и
оставляют до утра при комнатной температуре до окончательного учета.
Наиболее достоверная реакция плазмокоагуляции
наступает до 6 часов, после этого времени может иногда наблюдаться ложная
реакция.
2. Ускорение реакции производят двумя
приемами:
а) за счет использования 3 - 4-часовых
бульонных культур, добавляя их в количестве 0,1 куб. см к 0,5 куб. см
разведенной плазмы;
б) или в пробирку с 0,1 куб. см бульона
вносят петлю суточной культуры стафилококка. После выдержки в термостате при
+37 °С в течение 1 часа в пробирку добавляют 0,3 куб.
см кроличьей плазмы и пробирки дополнительно выдерживают в течение 2 - 6 часов
до свертывания плазмы (оставляют на ночь при комнатной температуре).
В случае
необходимости подтверждения и уточнения результатов реакции плазмокоагуляции
культуры изучаемых штаммов стафилококков пересевают 2 - 3 раза на скошенном агаре и повторяют постановку реакции или рассевают культуры
на чашках с питательным агаром (ПА) для проведения
повторной идентификации из новых колоний стафилококков.
Реакция ферментации маннита
в анаэробных условиях.
Используют среду, приготовленную из
сухого препарата с индикатором ВР и маннитом, которую
разливают в пробирки по 10 куб. см, стерилизуют 0,7 атм. 20 минут. Перед
посевом среду освобождают от воздуха, для чего пробирки кипятят в водяной бане
при 100 °C 10 минут, затем быстро охлаждают в холодной воде и немедленно
производят посев уколом. Сверху засеянную среду заливают расплавленным 2%
водным агаром слоем 2 - 3 см, чтобы исключить
попадание воздуха. Посевы термостатируют на 2 - 4
сутки. Результаты расценивают как ферментацию маннита,
когда нижняя и верхняя части среды четко изменяют цвет
из зеленого на синий. В этом случае микроорганизмы идентифицируют как Staphylococcus aureus. Если
посинеет только верхняя часть среды, то имеет место неспецифическое окисление маннита. Если спустя 4 дня инкубации не произошло
посинение, то можно считать, что ферментация маннита
отсутствует.
При сомнительных результатах
целесообразно из первичных посевов взять ряд других колоний и подвергнуть их
вновь идентификации. Кроме основных тестов следует использовать дополнительные:
определить наличие фосфатазы и термостабильной ДНКазы,
характеризующие принадлежность стафилококков к Staphylococcus
aureus.
4. СМЫВЫ
Смывы производят в соответствии с
"Методическими указаниями по санитарно-бактериологическому контролю на
предприятиях общественного питания и торговли пищевыми продуктами", утв.
зам. нач. ГСЭУ МЗ СССР за N 2657 31.12.82, с оборудования, инвентаря,
санитарной одежды, рук работников до начала работы, с автоклавированной
пергаментной бумаги (тара для творога), а также контролируют качество обработки
бутылочек, используя для исследования смывную жидкость после ополаскивания
бутылочек, подготовленных к заполнению готовой продукцией.
Для этого в одну из трех доставленных
бутылочек наливают 10 куб. см стерильной водопроводной воды. Бутылочку
ополаскивают и воду над пламенем горелки последовательно переливают во 2-ю и
3-ю бутылочки.
Исследование смывной жидкости
Объем исследований:
а) общая микробная обсемененность
(определяется только в смывной воде с бутылочек);
б) наличие микробов группы кишечных
палочек;
в) наличие Staphylococcus
aureus.
Наличие микробов
группы кишечных палочек - 8 мл оставшейся смывной жидкости с бутылочек засевают
на 1 куб. см концентрированной среды Эйкмана и
инкубируют в термостате 24 часа при 43°. Дальнейший ход исследования и
идентификации микробов группы кишечных палочек проводится по вышеуказанной
методике.
Смывную жидкость с других объектов
исследуют, как указано в "Методических рекомендациях" от 31.12.82 за
N 2657.
Общая микробная обсемененность определяется
в смывной воде бутылочек. При вычислении результатов число колоний, выросшее
при посеве, умножают на 10, что соответствует содержанию колоний микробов в
смыве с 3-х бутылочек. Считается качество обработки бутылочек
удовлетворительным при росте в 1 куб. см смывной жидкости не более 10 колоний.
Наличие Staphylococcus
aureus определяется при посеве тампоном смывной
жидкости на поверхность питательных сред МСА и ЖСА, далее исследование
необходимо проводить, как указано выше.
5. ОФОРМЛЕНИЕ
РЕЗУЛЬТАТОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО
ИССЛЕДОВАНИЯ ДЕТСКИХ МОЛОЧНЫХ СМЕСЕЙ
В протоколе исследований необходимо
указывать:
а) общую микробную обсемененность в 1
куб. см продукта;
б) титр бактерий группы кишечных палочек
(в кисломолочных и вареных смесях); бактериоскопия;
в) наличие или отсутствие Staphylococcus aureus в 1 г/куб.
см кисломолочных продуктов;
г) в смывах указать наличие или
отсутствие бактерий группы кишечных палочек и Staphylococcus
aureus;
д) в смыве с 3-х бутылочек указать общую
микробную обсемененность в 1 куб. см.
Приложение N 1
к Методическим рекомендациям
6. ПЕРЕЧЕНЬ
ИССЛЕДУЕМЫХ ДЕТСКИХ МОЛОЧНЫХ СМЕСЕЙ В
СООТВЕТСТВИИ
С "ИНСТРУКЦИЕЙ...", УТВ. МЗ СССР
13.04.80 N 08-14/3-14
1. Молоко цельное
2. Молоко с отварами B-рис, B-гречка,
B-овес
3. Кефир цельный
4. B-кефир с отварами
5. Биолакт-1
6. Биолакт-2
7. Ацидофильное молоко
8. Ацидофильная паста
9. Обезжиренный кисломолочный продукт
(пахтанье)
10. Творог
11. Творог, твогреча
12. Сливки
13. Каша манная 5% и 10%
14. Каша из муки 10%
15. Кисели из фруктов и ягод <*>
16. Витаминные напитки <*>
--------------------------------
<*> Приготовление протертых из
фруктов и ягод витаминных напитков, киселей допускается только при наличии
необходимых для их выработки помещений, оборудования и кадров.
Приложение N 2
к Методическим рекомендациям
7. ТАБЛИЦА
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИТРА МИКРОБОВ ГРУППЫ КИШЕЧНЫХ
ПАЛОЧЕК
объемы
10,0; 1,0; 0,1; 0,01
┌──────────┬───────────┬───────────┬────────────┬────────────────┐
│ 10,0
│ 1,0 │
0,1 │ 0,01
│ Коли-титр │
├──────────┼───────────┼───────────┼────────────┼────────────────┤
│ -
│ - │
- │ -
│Более 11,1 │
│ -
│ - │
- │ +
│ 11,1 │
│ -
│ - │
+ │ -
│ 11,1 │
│ -
│ + │
- │ -
│ 10,5 │
│ -
│ - │
+ │ +
│ 5,6 │
│ -
│ + │
- │ +
│ 5,3 │
│ -
│ + │
+ │ -
│ 4,6 │
│ +
│ - │
- │ -
│ 4,3 │
│ -
│ + │
+ │ +
│ 3,6 │
│ +
│ - │
- │ +
│ 1,1 │
│ +
│ - │
+ │ -
│ 1,0 │
│ +
│ - │
+ │ +
│ 0,6 │
│ +
│ + │
- │ -
│ 0,4 │
│ +
│ + │
- │ +
│ 0,1 │
│ +
│ + │
+ │ -
│ 0,04 │
│ +
│ + │
+ │ +
│Менее 0,04 │
└──────────┴───────────┴───────────┴────────────┴────────────────┘
Приложение N 3
к Методическим рекомендациям
8. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ТЕСТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Определение активности кислой фосфатазы
Среда: к 100 мл 2% ПА, расплавленного и
остуженного до 45°, добавляют 50 мг паранитрофенилфосфата
натрия, разливают в чашки Петри. Посев производят бляшками - до 20 бляшек на
чашку. Реакцию нужно учитывать через 2 часа инкубации при 37 °С. Вокруг бляшек
при положительной фосфатазной реакции среда
окрашивается в желтый цвет. Интенсивность окрашивания увеличивается через 18 -
24 часа - практически окрашивается вся среда и дифференцированный учет реакции
не возможен. В случае отсутствия сухой кроличьей плазмы рекомендуется данную
реакцию использовать для отбора коагулазоположительных
штаммов стафилококков, т.к. если фосфатазный тест
положительный, то коагулазный тест также всегда
положительный и, наоборот, отсутствие фосфатазы свидетельствует об отсутствии коагулазы.
Тест на наличие термостабильной дезоксирибонуклеазы (ДНКазы)
ДНКаза определяется по методу, основанному на метахроматических свойствах толуидина голубого. Этот метод
диффузии в агар термостабильной ДНКазы
Staphylococcus aureus
позволяет определить ее в концентрации примерно 0,005 мкг.
Среда:
к 1000 куб. см 0,05М трис-буфера (оксиметиламинометан),
рН 9,0
добавляют 0,3
г ДНК, затем
10,0 г агара, 1 куб.
см 0,01М CaCl , 10,0 г
2
NaCl, 3,0 мл 0,1М толуидина
голубого. Среду разливают в пробирки по 12 - 15
мл, закрывают
резиновыми пробками и хранят в холодильнике до 3 - 5 месяцев.
Перед постановкой
реакции среду растапливают и разливают в чашки Петри,
подсушивают при +4
°C (холодильник) в течение 1
часа, вырезают лунки
диаметром 3 мм,
отсасывают пипеткой агар и в
лунки специальной пипеткой
вносят культуры,
инкубируют при 37 °С.
Перед изучением культур пробирки с
суточным ростом стафилококков на полужидком агаре прогревают в кипящей водяной бане 15 минут и вновь
вносят в лунки в агаровой пластинке, содержащей толуидин
голубой. Зоны просветления с розовым окрашиванием образуются в результате
гидролиза ДНК, находящейся в среде, термостабильной ДНКазой
стафилококков. Появление через 1 - 2 часа после внесения розовоокрашенных
зон расценивается как положительная реакция на наличие термостабильной ДНКазы.
Примечание: В настоящее время
исследователи предлагают тест определения термостабильной нуклеазы для
ретроспективного обнаружения клеток Staphylococcus aureus в термически обработанных пищевых продуктах
вследствие терморезистентности этого фермента
(нуклеаза). Но исследователи считают, что корреляция между количеством
стафилококков, которыми был обсеменен продукт, и активностью нуклеазной реакции не существует. Отдельные штаммы
стафилококков различаются по количеству продуцируемого фермента. Как показали
исследователи, нуклеаза появляется у штаммов стафилококков чаще, чем энтеротоксины. Следует помнить, что обнаружение
термостабильной нуклеазы в пищевых продуктах, не связанных с пищевой интоксикацией,
не может свидетельствовать о наличии в них энтеротоксинов.
Наличие термостабильной нуклеазы более
показательно для штаммов стафилококков, выделенных из продуктов и найденных в
самих продуктах, инкриминированных при пищевых стафилококковых интоксикациях.
Приложение N 4
к Методическим рекомендациям
9. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
1. Среда Кесслер
(модифицированная): к 1 литру воды добавляют 10 г пептона и 50 куб. см желчи
крупного рогатого скота. Кипятят при помешивании 20 - 30 минут, фильтруют через
вату, прибавляют 2,5 г глюкозы, объем доводят до 1 литра, устанавливают рН 7,4
- 7,6, добавляют 2 мл 1% водного раствора кристаллического фиолетового,
разливают по 5 - 10 мл в пробирки с поплавками. Стерилизуют при 121° 15 - 20
минут. Готовая среда должна иметь темно-фиолетовый цвет.
2. Солевой бульон: к 100,0 куб. см
питательного бульона рН 7,0 - 7,4 добавляют 6,5 г поваренной соли. Разливают в
колбы по 1,0 куб. см. Стерилизуют при 121° 20 минут.
3. Молочный агар:
к 100,0 куб. см стерильного питательного агара
добавляют 10,0 куб. см снятого стерильного молока рН 7,4.
4. Снятое молоко: молоко центрифугируют,
удаляют сливки, разливают в пробирки по 5,0 и 10,0 куб. см и стерилизуют при
121° 10 минут.
5. Желточная среда (для определения лецитовителлазной активности стафилококков). К 300,0 куб.
см 2,5% МПА (питательного агара), растопленного и
остуженного до 45°, добавляют 100 куб. см желточной эмульсии, тщательно
смешивают и разливают в чашки Петри. Приготовление желточной эмульсии: к 200
куб. см изотонического раствора натрия хлорида стерильно добавляют желток
одного куриного яйца, размешивают до получения гомогенной эмульсии.
6. Кроличья сухая плазма выпускается
Белорусским институтом эпидемиологии и микробиологии.
Адрес: Минск, ул. Ногина, 3.
7. Среда Ресселя
с мочевиной из сухих питательных сред.
К 100 мл горячей стерильной
дистиллированной воды добавляют 4 г сухого препарата с индикатором ВР и
лактозой, 0,1 г глюкозы и 1 г мочевины. Полученную среду разливают в стерильные
пробирки по 5 - 6 мл и стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин. или текущим паром 2 дня
подряд по 15 - 20 минут.
Приложение N 5
к Методическим рекомендациям
10. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ, ВЫПУСКАЕМЫЕ В ГОТОВОМ ВИДЕ
┌───┬──────────────────────────────────────────┬──────────────────────────┐
│
N │ Название
среды │ Изготовитель │
│п/п│ │ │
├───┼──────────────────────────────────────────┼──────────────────────────┤
│1.
│Сухой питательный агар │Даг.
НИИПС (г. Махачкала) │
│2.
│Сухой питательный бульон │-"- │
│3.
│Агар Эндо │-"- │
│4.
│Агар с эозин-метиленовым
синим (Левина) │-"- │
│5.
│Препараты с индикатором ВР и сахарами:
│ │
│ │
- с глюкозой
│-"- │
│ │
- с сахарозой
│-"- │
│ │
- с многоатомным спиртом маннитом │-"- │
│6.
│Солевой агар │-"- │
│7.
│Бульон Хоттингера │ИЭМ им. Гамалеи АМН СССР │
│ │ │г.
Москва │
│8.
│Олькеницкого, ГОСТ 9958-74 │ │
└───┴──────────────────────────────────────────┴──────────────────────────┘
Приложение N 6
к Методическим рекомендациям
11. СПЕЦИФИКАЦИЯ ПРИМЕНЯЕМЫХ ХИМИЧЕСКИХ РЕАКТИВОВ
И ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
┌───┬───────────────────────────┬─────────────────┬────────────┬──────────┐
│
N │ Технологическое, │ N ГОСТ, ОСТ или │Квалификация│Примечание│
│п/п│
фармацевтическое или │статьи
фармакопеи│ │ │
│ │
торговое название │ │ │ │
│ │ материала │ │ │ │
├───┼───────────────────────────┼─────────────────┼────────────┼──────────┤
│
1 │ 2 │ 3
│ 4 │
5 │
├───┼───────────────────────────┼─────────────────┼────────────┼──────────┤
│1.
│Агар микробиологический │17206-71 │Высший сорт │ │
│2.
│Бульон мясопептонный │20730-75 │ │ │
│3.
│Бромтимоловый синий,
инд. │ТУ 6-09-2086-72 │ч.д.а. │ │
│4.
│Вода дистиллированная │67-09-72 │ │ │
│ │стерильная │ │ │ │
│5.
│Д-глюкоза │6038-74 │х.ч. │ │
│6.
│Лактоза │6038-74 │х.ч. │ │
│7.
│Маннит │8321-74 │х.ч. │ │
│8.
│Натрий едкий │11078-71 │ │ │
│9.
│Натрий серноватистокислый │4276-66 │х.ч. │ │
│ │(тиосульфат) │ │ │ │
│10.│Натрий
хлористый │4233-77 │х.ч. │ │
│11.│Натрий
двууглекислый │4201-66 │х.ч. │ │
│12.│Спирт
этиловый │5964-67 │ │96° │
│ │ректификованный │ │ │ │
│13.│Реактивы
для окраски по │18963-73 │ │ │
│ │Граму │ │ │ │
│14.│Фуксин
кислый, инд. │ТУ 200254 │х.ч. │ │
│15.│Фосфатаза
кислая из
│ТУ 6-09-23-40-73 │ │ │
│ │Aspergillus
terreus │ │ │ │
│ │Фосфогидролаза
моноэфиров │ │ │ │
│ │ортофосфорной кислоты │ │ │ │
│ │К.Ф.З. N 1, 3.2 │ │ │ │
│16.│Толуидиновый
голубой │МРТУ 6-09 2621-65│ │ │
│17.│Трис(оксиметил)аминометан │ТУ 6-09-10-780-72│ │ │
│ │сернокислый │ │ │ │
│18.│Трис(оксиметил)аминометан │ТУ 6-09-10-762-72│ │ │
│ │уксусный │ │ │ │
│19.│Натриевая
соль ДНК, │ │ │ │
│ │ОлаинскиЙ
завод │ │ │ │
│20.│Агар-агар │ГОСТ 17206-71 │ │ │
└───┴───────────────────────────┴─────────────────┴────────────┴──────────┘