Утверждаю
Заместитель Министра
рыбного хозяйства СССР
А.Н.ГУЛЬЧЕНКО
24 марта 1983 года
Согласовано
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача СССР
А.И.ЗАИЧЕНКО
21 марта 1983 года
(письмо N 123-5/133"А"-12)
Начальник Центральной
санитарной инспекции
Б.А.ДАВЫДОВ
3 февраля 1983 года
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ
КОНТРОЛЮ ЧЕРНОМОРСКИХ МИДИЙ И УСТРИЦ
(В порядке производственного испытания)
1. ВВЕДЕНИЕ
Методические указания рассчитаны на
работников производственных лабораторий и санэпидстанций при проведении
санитарно-бактериологического контроля устриц и мидий, используемых на пищевые
цели в свежем виде или для приготовления пищевой продукции.
Двустворчатые моллюски (устрицы, мидии) в
процессе своей жизнедеятельности в организме накапливают микроорганизмы из
окружающей их морской воды. Поэтому в моллюсках, выловленных или выращенных в
загрязненных районах моря, могут быть различные микроорганизмы и вирусы,
патогенные для человека.
Способность моллюсков к накоплению из
морской воды патогенных для человека микроорганизмов и то, что некоторые виды
из них, например, устрицы и мидии, употребляются в пищу в свежем (живом) виде
без предварительной термической обработки обуславливает особые требования к
этому виду пищевой продукции.
При составлении Методических указаний
использованы методики, разработанные МНИИГ им. Ф.Ф. Эрисмана, 2-м Московским
медицинским институтом, опробованные авторами инструкции при санитарно-бактериологическом
контроле моллюсков на Черном море, требования, содержащиеся в ТУ 15-04-352-80 и
ТУ 15-04-354-80, "Устрицы черноморские живые", "Мидии
черноморские живые", данные отечественной и зарубежной санитарной
статистики.
2. СХЕМА И
ПЕРИОДИЧНОСТЬ САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО
КОНТРОЛЯ МОЛЛЮСКОВ
Санитарно-микробиологический контроль
устриц и мидий проводится бактериологическими лабораториями предприятий,
хозяйств и санэпидстанциями.
Контролируется каждая подготовленная к
реализации партия моллюсков. Партией считаются устрицы или мидии одного района
и даты вылова или подъема коллекторов, предъявляемые одним предприятием к
одновременной сдаче-приемке и оформленные одним документом, удостоверяющим их
качество.
В каждой партии моллюсков (устриц и мидий)
определяется содержание бактерий группы кишечной палочки, общая
бактериологическая обсемененность, а наличие сальмонелл и парагемолитических
вибрионов производится по эпидемиологическим показаниям по требованию органов
саннадзора в указанных ими лабораториях.
3. ОТБОР И
ПОДГОТОВКА ПРОБ К МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ
Для проведения микробиологических
исследований из разных мест партий устриц или мидий, предназначенных к
реализации, отбирают по 10 экземпляров моллюсков. Моллюсков очищают от
обрастаний и промывают под струей проточной воды. После этого наружную
поверхность створок моллюсков облучают в боксе ультрафиолетовыми лучами
ртутно-кварцевой лампы 15 - 20 мин. Затем профламбированным скальпелем
разрезают мускул-замыкатель, раскрывают створки и извлекают мясо моллюсков
(мантию, жабры, печень, ногу и др. органы) с межстворчатой жидкостью. Ткани
моллюсков измельчают сначала профламбированными ножницами, затем в стерильной
фарфоровой ступке пестиком со стерильным песком или в гомогенизаторе до
получения однородной массы.
Из 1 куб. см гомогената готовят
разведения на стерильном физиологическом растворе для определения общей
бактериальной обсемененности; оставшийся гомогенат используют для проведения
других исследований - определения содержания бактерий группы кишечной палочки,
наличия сальмонелл и парагемолитических вибрионов.
4. МЕТОДИКИ
КОНТРОЛЯ
4.1. Определение
общей бактериальной обсемененности
Общая бактериальная обсемененность
определяется по количеству колоний сапрофитных бактерий (мезофильных аэробов и
факультативных анаэробов), вырастающих при посеве 1 куб. см или 1 г
исследуемого материала на обычных питательных средах (РПА и др.) за 24 часа при
37 °С, образующих колонии, видимые простым глазом или
при увеличении в 2 - 5 раза.
4.1.1. Проведение анализа
В зависимости от предполагаемого
загрязнения производят посев не менее двух различных объемов гомогената мидий
или устриц, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках Петри вырастало не
более 300 колоний.
-1 -2 -3
Для
получения разведений гомогената
(10 , 10
, 10 и
т.д.)
используют
стерильный физиологический раствор.
Из пробирок с разведениями гомогената в
соответствии со степенью предполагаемого загрязнения берут по 1 куб. см и
вносят в стерильные чашки Петри. На крышках чашек Петри перед посевом
необходимо написать номер пробы, разведение и дату посева. Посевы заливают 15 -
25 куб. см расплавленного в водяной бане и охлажденного до 45
°С питательного агара (РПА, РПА на морской воде). После застывания агара
чашки переворачивают крышкой вниз и помещают в термостат с
температурой 37 °С. Инкубирование производят 24 часа.
Подсчет колоний производят при помощи
лупы с увеличением в 2 - 5 раз или прибора для счета колоний. Для удобства
каждую подсчитанную колонию отмечают со стороны дна чашки тушью или чернилами
для стекла.
Если на чашках вырастает свыше 300
колоний и анализ нельзя повторить, колонии подсчитывают при помощи пластинки с
сеткой и лупы при сильном боковом освещении. Подсчитывают не менее 20 квадратов
площадью 1 кв. см каждый в разных местах чашки, затем выводят среднее
арифметическое числа колоний на 1 кв. см, величину которого умножают на площадь
чашки.
Не учитывают чашки, на которых
преобладает ползучий рост спорообразующих бактерий. Если он занимает менее
половины площади чашки, то подсчет колоний производят на свободном участке,
применяя счетную пластинку. При этом подсчитывают квадраты на свободных от
сплошного роста местах чашки.
Результаты подсчета колоний в каждой
чашке выражают в количестве бактерий на 1 куб. см анализируемого гомогената
мидий или устриц, для чего число выросших на чашке колоний умножается на степень
разведения гомогената. За окончательное количество бактерий принимается среднее
арифметическое результата подсчета на 2 - 3 параллельных чашках или различных
разведений.
4.2. Определение
бактерий группы кишечной палочки
(БГКП)
Определение количества БГКП производится
в 2-х параллельных рядах путем посева различных объемов (1,0; 0,1; 0,01 куб.
см) гомогената моллюсков в лактозно-пептонную среду. Инкубация посева
производится при 37 °С в течение 18 - 24 часов.
Учет результатов производится по образованию
кислоты и газа. Из этих пробирок, а также из пробирок с образовавшейся
кислотой, но без газа или с наличием газа при слабом образовании кислоты
производят подтверждающий высев на среду Эндо. Посевы
инкубируют 18 - 24 часов при 37 °С.
Если на секторах среды
Эндо выросли темно-красные с металлическим блеском и без него, розовые и
бесцветные колонии, то их принадлежность к БГКП подтверждают микроскопированием
мазков, окрашенных по Граму, и постановкой оксидазного теста.
4.2.1. Окраска по Граму (в модификации
МНИИГ им. Ф.Ф. Эрисмана)
На предметное стекло, тщательно протертое
спиртом, наносят с лицевой стороны стекла карандашом для стекла квадраты по
числу мазков.
При исследовании роста на плотных средах
наносят бактериологической петлей каплю дистиллированной воды, в нее вносят
небольшое количество исследуемой культуры, затем 1 каплю красителя А и все тщательно смешивают. Оставляют на несколько минут
до подсыхания (не подогревать над горелкой!), после чего фиксируют трехкратным
проведением над пламенем горелки. Препарат промывают дистиллированной водой,
высушивают фильтровальной бумагой и наливают краситель Б. Продолжительность
второй окраски от 0,5 до 5 мин. Затем препарат промывают дистиллированной
водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.
4.2.2. Постановка оксидазного теста
Оксидазный тест является одним из тестов,
позволяющих дифференцировать БГКП от вибрионов, аэромонад, псевдомонад и др.,
обладающих положительной оксидазой.
По 2 - 3 изолированные колонии с секторов
среды Эндо снимают бактериологической петлей и
поочередно наносят штрихом на полоску фильтровальной бумаги, смоченной
реактивом, приготовленным по прописи, указанной в п. 7.2.5. Если бактерии имеют
активную оксидазу, то на месте нанесения культуры появляется синее окрашивание.
При отрицательной реакции цвет бактериальной массы не изменяется.
4.2.3. Оценка результатов анализа
определения БГКП
Результаты анализа выражают в количестве
БГКП в 1 куб. см гомогената тела моллюсков. Определение индекса производят по
таблице индексов при двухрядовом определении по Хоскинсу-Муру. Учету подлежат
только лактозоположительные кишечные палочки с отрицательной реакцией на
оксидазу.
4.3. Определение
сальмонелл
Определение сальмонелл производят только
в лабораториях, имеющих разрешение санэпидстанции.
Наличие сальмонелл определяют, используя
жидкие среды накопления с высевом на плотные элективные среды, выделением
чистых культур, биохимической и серологической идентификацией.
Наличие сальмонелл определяют в 25 куб.
см гомогената, засеваемого в 100 куб. см магниевой среды накопления. Через 20 -
24 часа инкубации посевов при 37 °С по 1 петле из
каждой колбы высевают на 1 - 2 чашки с висмут-сульфитной средой. Продление
инкубации посевов на висмут-сульфитной среде до 48 часов повышает
результативность исследований.
На висмут-сульфитной среде сальмонеллы
вырастают в виде черных колоний с металлическим блеском, просвечивающие с
обратной стороны. Некоторые биовары сальмонелл, не продуцирующие сероводорода,
могут вырастать в виде зеленых колоний.
Для получения достоверных результатов
необходимо снимать с чашек возможно большее число колоний.
С висмут-сульфитной среды производят
пересев на среду ДУКС-5. Посев производят штрихом по скошенной поверхности и
уколом в толщу столбика. Посевы инкубируют при 37 °С
20 - 24 часа. При росте сальмонелл происходят изменения в среде ДУКС (изменение
цвета, газ, образование сероводорода).
4.3.1. Изучение серологических свойств
сальмонелл
Изучение серологической структуры
сальмонелл производится с помощью постановки реакции агглютинации на стекле с
поливалентными и монорецепторными агглютинирующими адсорбированными
сальмонеллезными сыворотками.
Сухие сыворотки перед употреблением
растворяют согласно "Наставлению по применению", вкладываемому в
каждый набор сывороток.
Для реакции агглютинации с О-сыворотками
берут односуточную культуру в верхней части, с Н-сыворотками - с нижней части скошенного питательного агара, т.к. внизу находятся самые
подвижные особи. Вначале при помощи поливалентной сальмонеллезной О-сыворотки устанавливается принадлежность исследуемой
культуры к одной из серологических групп сальмонелл. Для определения
серологического типа культуры используют Н-монорецепторные сыворотки 1 и 2 фаз.
4.4. Определение
бактерий группы
парагемолитических вибрионов
Для
выделения парагемолитических вибрионов
25 куб. см исследуемого
гомогената тела
моллюсков засевают в
колбу со 100
мл 1-процентной
пептонной воды
с 3-процентным хлористым
натрием. Параллельно готовят
-1 -2
-3
Разведения гомогената (10 , 10 ,
10 ) на
1-процентной пептонной воде
с 3-процентным хлористым
натрием, которые высевают
на чашки на одну
из плотных
элективных дифференциальных сред
- агар с вторичными
алкилсульфатами натрия,
цветную среду Касаткина,
ТСВ в модификации
московской
Горсэс, дифференциально-диагностический агар.
Посевы инкубируют в термостате при 37°.
Через 16 - 18 часов делают пересев из среды накопления на элективную
дифференциальную среду и просматривают чашки с посевами. Парагемолитические
вибрионы образуют на средах, содержащих сахарозу и индикатор бромтимоловый
синий, плоско-выпуклые полупрозрачные колонии, круглые с ровными краями,
окрашенные в цвет среды (сине-зеленые), от 1 до 5 мм диаметром, а
алгинолитические - желтые неправильной формы.
При наличии подозрительных колоний на
следующем этапе определяют принадлежность выделенных культур к вибрионам.
Отобранные колонии пересевают на среду
Хью-Лейфсона и на щелочной агар с 3-процентным
хлористым натрием (ЩМПА). Посевы инкубируют при температуре 37° в течение 16 -
24 часов. Из культур, выросших на ЩМПА, окисляющих и ферментирующих глюкозу на
среде Хью-Лейфсона, готовят мазки, которые окрашивают по Граму, определяют
подвижность и ставят оксидазную пробу. При обнаружении в мазках
грамотрицательных прямых или изогнутых подвижных палочек и при наличии у
культуры оксидазной активности для окончательной идентификации проводят
следующие исследования (табл. 4.4.1):
1. Определение степени галофилии;
2. Расщепление углеводов и спиртов;
3. Определение протеолитической
активности;
4. Определение способности к образованию
индола;
5. Определение способности образовывать
ацетилметилкарбинол (ацетоин, реакция Фогес-Проскауэра);
6. Реакция с метиловым красным;
7. Декарбоксилирование аминокислот
(аргинин, лизин);
8. Определение гемолитических свойств.
4.4.1. Тесты окисления-ферментации
глюкозы
Способность выделенных культур окислять и
ферментировать глюкозу определяют на среде Хью-Лейфсона. Каждую культуру
засевают в две пробирки, после чего в одну из них вносят примерно 0,5 куб. см
стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют в течение 24 часов. Об
окислении судят по изменению окраски среды из зеленого в
желтый цвет в пробирке без вазелинового масла, о ферментации - по той же
окраске в пробирке с маслом.
Таблица 4.4.1
СХЕМА
ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ
ВИБРИОНОВ
(МОДИФИЦИРОВАННАЯ СХЕМА ГРИГОРЬЕВА В СОАВТОРСТВЕ,
1975)
Исследуемый материал
1-процентная пептонная вода Элективная
с 3-процентным хлористым
дифференциальная
натрием (среда накопления) среда (37 °С, 24 ч)
Элективная
дифференциальная среда
Типичные колонии
Пересев на среду Хью-Лейфсона и на ЩМПА (определение
оксидазной активности, окраска по Граму, подвижность)
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
1-процент- 1-процент- Среда Среда Среда ДАВГ Среда Гисса Кровяной
ная ПВ, ная ПВ
с Кларка <*> Кларка
<*> (37°, 24 ч) <***> с 3- агар с
содержащая 3-процент- с
3-про- с 3-про- Аргинин (-)
процентным 7-про-
NaCl (37°, ным центным центным
<**> хлористым центным
18 час.)
хлористым хлористым хлористым
Лизин (+) натрием
<*> хлористым
0% - (-)
натрием и натрием натрием (37°, 18 час.) натрием
3% - (+) триптофа-
(37°, (37°, Арабиноза (+) (37°,
8% - (+) ном
(37 °С 24 час.).
24 час.). Глюкоза (+) 24 час.)
10% - (-) 18 -
24 Реакция Реакция с Инозит (-) Гемолиз
час.). Фогес- метиловым Ксилоза (-) (+/-)
Образова-
Проскауэра красным (+) Лактоза (-)
ние
индола (образова- Мальтоза (+)
(+) ние ацетил-
Маннит (+)
метилкарби- Сахароза (-)
нола) (-) Сорбит (-)
--------------------------------
<*> Содержание хлористого натрия в
средах для определения биохимических свойств бактерий уменьшено до 3% вместо
5%.
<**> Уменьшено количество
аминокислот до 2 (аргинин, лизин) при определении декарбоксилазной активности.
<***> Уменьшено количество
углеводов и спиртов при определении способности их ферментации.
Вибрионы окисляют и ферментируют глюкозу
- псевдомонады только окисляют.
4.4.2. Определение подвижности
Подвижность культур можно определить
несколькими способами:
а) При микроскопии суточных культур с
пептонной воды или щелочного агара в разбавленной
капле с фазовоконтрастным объективом. Подвижные культуры активно перемещаются в
поле зрения.
б) Посевом культуры уколом в столбик 0,25
- 0,3% полужидкого питательного агара. Подвижные
культуры дают диффузное помутнение всего столбика, неподвижные и слабо
подвижные вырастают только по уходу укола.
4.4.3. Определение оксидазной активности
(см. п. 4.2.2)
4.4.4. Определение степени галофилии
Способность выделенных штаммов к росту на
пептонной воде с различным содержанием хлористого натрия является важным
дифференциальным признаком при идентификации парагемолитических вибрионов в их
делении на два биотипа. Для определения степени галофилии по 0,06 куб. см (1
капле) 3 - 4 часовой культуры засевают в пробирки с 5 куб. см 1-процентной
пептонной воды, содержащей 0%, 8% и 10% хлористого натрия. Посевы инкубируют в
течение 18 - 24 часов, рост определяют по помутнению среды. Парагемолитические
вибрионы не растут на среде без хлористого натрия и дают обильное помутнение в
пробирках с 8-процентным хлористым натрием, а алгинолитические - в пробирках с
8, 10% хлористого натрия. Иногда из внешней среды выделяются культуры
парагемолитических вибрионов, способные к росту в присутствии 10-процентного
хлористого натрия.
4.4.5. Ферментация углеводов и спиртов
Парагемолитические вибрионы обладают
небольшим периодом генерации, что позволяет в короткий срок определить их
биохимическую активность в отношении различных углеводов и спиртов. Из широкого
набора углеводов и спиртов диагностическое значение для идентификации
парагемолитических вибрионов имеет ферментация маннита, сахарозы, арабинозы,
маннозы и инозита.
Ферментативную активность выделенных
культур определяют на средах Гисса, содержащих 3% хлористого натрия. Посевы
инкубируют в течение 24 часов при температуре 37 °С. При посеве густой
бактериальной суспензии результаты можно учитывать уже через 6 часов.
О ферментации судят по изменению цвета
среды в пробирках, об образовании газа - по наличию пузырьков в толще
полужидкой среды или в поплавках. Ферментация сопровождается подкислением среды
и изменением ее цвета в желтый при использовании в
качестве индикатора бромтимолового синего и в ярко-розовый - с индикатором
Андреде.
Для парагемолитического вибриона
характерна ферментация без газообразования глюкозы, маннита и маннозы, для
алгинолитического - глюкозы, маннита, маннозы, сахарозы и арабинозы.
Выделены штаммы парагемолитического
вибриона, способные к ферментации сахарозы и арабинозы, а штаммы
алгинолитического вибриона не разлагают арабинозу.
4.4.6. Определение протеолитической
активности
Наличие протеолитической активности
определяют посевом исследуемых культур на питательную желатину. Культуры
засевают уколом в столбик желатины, посевы инкубируют при температуре 37° в
течение 24 часов. Затем пробирки с посевами и контрольную пробирку на некоторое
время (20 - 30 мин.) помещают в холодильник. При положительном результате в
засеянной пробирке желатина остается жидкой, а в контрольной - затвердевает.
Парагемолитические вибрионы обладают протеолитической активностью.
4.4.7. Определение способности
образовывать ацетилметилкарбинол (реакция Фогес-Проскауэра)
Для определения способности образовывать
ацетилметилкарбинол ставят реакцию Фогес-Проскауэра. Исследуемые культуры
засевают в пробирки с 5 куб. см глюкозофосфатного бульона Кларка с 3%
хлористого натрия, выращивают в течение суток при 37 °С. К 1 мл выросшей культуры
добавляют 0,6 альфа-нафтола (6-процентный р-р в
абсолютном спирте) и 0,2 куб. см 40-процентного едкого калия (KOH). Пробирки
хорошо встряхивают и помещают в термостат на 30 минут при 37
°С. При положительной реакции наступает рубиново-красное окрашивание
среды.
4.4.8. Образование индола
Выявление способности образовывать индол
определяют на 1-процентной пептонной воде с 0,03% DL-триптофана и 3% хлористого
натрия. Культуры засевают в пробирки и под ватно-марлевые пробки вставляют
бумажки для определения индола. Посевы инкубируют при 37 °С
в течение 24 часов. Наличие индола в среде можно определить также при помощи
реактива Эрлиха или Ковача. Появление в среде красного кольца или красного
окрашивания после внесения одного из реактивов и 1-часовой инкубации в
термостате свидетельствует о наличии индола.
4.4.9. Реакция с метиловым красным
В 18 - 24-часовую культуру, выросшую на
среде Кларка с 3-процентным хлористым натрием при температуре 37 °С, по каплям (3 - 5 капель) прибавляют 0,04-процентный р-р
метилового красного. Пробирки хорошо встряхивают и на час помещают в термостат
при температуре 37 °С. При сильном кислотообразовании среда окрашивается в
красный цвет, при слабом - в желтый.
4.4.10. Определение декарбоксилазной
активности
Декарбоксилазная активность выделенных
культур является важнейшим дифференциальным признаком, позволяющим отличить
парагемолитические вибрионы от сходных с ними по
свойствам аэромонад. Для вибрионов характерно наличие декарбоксилазы лизина и
отсутствие декарбоксилазы аргинина. Аэромонады способны
декарбоксилировать аргинин.
Декарбоксилазную активность выделенных
микроорганизмов определяют на модификацированной среде ДАГВ (Григорьев Ю.И. и
др., 1975). По 2 петли (0,2 куб. см) бульонной исследуемой суточной культуры
бактерий засевают в 3 пробирки с 2 куб. см среды ДАГВ. Одна служит контролем,
две другие содержат аминокислоты: аргинин и лизин. После посева в каждую
пробирку для создания анаэробных условий вносят по 0,5 куб. см стерильного
вазелинового масла. Посевы инкубируют при 37 °С в
течение 24 часов. Культуры, у которых отсутствуют декарбоксилазы указанных
аминокислот, не расщепляют аминокислоты, но окисляют глюкозу, что приводит к
изменению окраски среды в желтый цвет, который сохраняется в течение всего
времени наблюдения как в опытах, так и в контрольных
пробирках. При наличии декарбоксилаз после окисления глюкозы и перехода окраски
среды в желтый цвет начинается ощелачивание среды за счет разложения
аминокислот, и среда вновь приобретает темно-фиолетовую окраску. Парагемолитические
вибрионы обладают декарбоксилазной активностью в отношении обеих аминокислот:
аргинина и лизина.
4.4.11. Определение гемолитической
активности
Способность культур парагемолитических
вибрионов гемолизировать эритроциты человека или кролика на кровяном
агаре, содержащем 7% хлористого натрия, коррелирует с энтеропатогенными
свойствами этих микроорганизмов.
Для определения гемолитической активности
используется среда Вагатцума или кровяной агар в модификации, предложенной
Григорьевым с соавторами.
1 петлю суточной бульонной культуры или
культуры со ЩМПА рассеивают штрихом или сеют "бляшкой" на кровяной агар. Чашки инкубируют при температуре 37 °С 24 - 48 часов. Вокруг колоний культур, обладающих
гемолитической активностью, образуются различного диаметра прозрачные зоны
гемолиза эритроцитов.
5. ОЦЕНКА
РЕЗУЛЬТАТОВ КОНТРОЛЯ
Употребление в пищу моллюсков, зараженных
патогенной для человека микрофлорой, в сыром или недостаточно термически
обработанном виде может привести к пищевым отравлениям и другим серьезным
заболеваниям. В странах, занимающихся разведением и промыслом моллюсков,
вопросы санитарного контроля моллюсков постоянно находятся в центре внимания
санитарных служб. На важность санитарного контроля за
соблюдением гигиенических правил при разведении и реализации моллюсков и
продуктов из них указывает Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ).
Микробиологические критерии
являются одними из важнейших при
определении
пригодности моллюсков в
пищу. Во многих странах разработаны
различные бактериологические стандарты
чистоты моллюсков, большинство из
которых, несмотря на некоторые отличия между собой, основаны
на определении
бактерий группы
кишечной палочки. Стандарты
разных стран допускают их
различное содержание
в моллюсках - от 5 до
менее 1 клетки в 1 г тела
моллюсков. Учитывая
случаи пищевых отравлений
моллюсками, вызванные
неспецифическими микроорганизмами, в
некоторые стандарты введены также
4
ограничения общего
количества микроорганизмов в 1
куб. см - 8 х 10 по
5
ГОСТу БДС-780075
Народной Республики
Болгарии, 5 х 10 по
английскому
стандарту.
Обнаружение сальмонелл в объемах
пищевых продуктов, превышающих 25 г,
не имеет
эпидемиологического значения.
Вспышки
пищевых
токсикоинфекций, вызываемые парагемолитическими
вибрионами,
при употреблении в
пищу морепродуктов отмечены во
многих
странах мира. Продукты,
вызывающие эти отравления,
обсеменены
6
парагемолитическими
вибрионами на высоком уровне (10 /г и выше).
В СССР мидии и устрицы используются в пищу
в различном виде - сыром (живом) и после термической обработки. В зависимости
от этого целесообразно ввести различные бактериологические нормативы для этих
двух видов продуктов.
Устрицы и мидии, направленные в торговую
сеть для реализации и употребления в пищу в живом виде, должны соответствовать
требованиям, приведенным в табл. 5.1.
Таблица 5.1
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ МИДИЙ И УСТРИЦ,
НАПРАВЛЯЕМЫХ
ДЛЯ РЕАЛИЗАЦИИ В ЖИВОМ ВИДЕ
┌───┬───────────────────┬───────────────────────┬────────────────┐
│
N │ Наименование │ Допустимый показатель │
Периодичность │
│п/п│
бактерий │ │ контроля
│
├───┼───────────────────┼───────────────────────┼────────────────┤
│ │ │ 4 │ │
│1.
│Общая бактериальная│Не более 2 х 10 в │каждая
партия │
│ │обсемененность │1 куб. см │ │
│2.
│Бактерии группы │Отсутствие
в 1 куб. см │-"- │
│ │кишечной палочки │ │ │
│3.
│Сальмонеллы │Отсутствие
в 25 куб. см│периодически <*>│
│4.
│Парагемолитические │Отсутствие в 25 куб. см│-"- │
│ │вибрионы │ │ │
└───┴───────────────────┴───────────────────────┴────────────────┘
--------------------------------
<*> Анализ на сальмонеллы и другую
патогенную микрофлору проводится по эпидемиологическим показаниям, по
требованию органов саннадзора в указанных ими лабораториях.
Мидии и устрицы, используемые для
приготовления консервов или термически обработанных кулинарных изделий, не
должны содержать более 5 клеток БГКП в 1 куб. см гомогената моллюсков.
6.
САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ МОРСКОЙ ВОДЫ
Одновременно с
санитарно-микробиологическим контролем моллюсков производится контроль морской
воды из районов разведения и добычи моллюсков. Санитарно-микробиологический
контроль морской воды предусматривает определение общего количества
микроорганизмов и БГКП.
6.1. Отбор проб морской воды
Отбор проб морской воды в районах
мидийных и устричных плантаций производится с плавсредств с поверхности над
коллекторами и с глубины у окончания нижней подборы коллектора.
Отбор морской воды с поверхности
производится в стерильную посуду емкостью 500 куб. см, погружаемую на 15 см от
поверхности воды. Отбор воды с глубины производится простерилизованным
батометром.
Отобранная морская вода доставляется в
наиболее кратчайшие сроки в лабораторию. Доставка в летнее время производится в
сумках "Холод" или в специально приспособленных термосах со льдом.
К пробам прилагается сопроводительная
документация с подписью ответственного лица, в которой указывается район отбора
пробы, глубина, температура воды, время и дата отбора пробы.
6.2. В настоящее время в районах
выращивания промысловых видов моллюсков санитарно-микробиологический контроль
морской воды и определение ее качества производится в соответствии с
"Методическими указаниями по гигиеническому контролю загрязнения морской
среды" от 19.01.81.
7. ПРИГОТОВЛЕНИЕ
ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И РЕАКТИВОВ
7.1. Среды для
определения общей
бактериальной обсемененности
7.1.1. Питательный агар (РПА)
Готовят из сухого препарата Дагестанского
НИИ питательных сред по прописи на этикетке.
7.1.2. Питательный
агар на морской воде
Готовят из сухого препарата Дагестанского
НИИ питательных сред, используя вместо дистиллированной
морскую воду.
7.2. Питательные
среды и реактивы для выделения БГКП
7.2.1. Лактозо-пептонная среда (ЛПС)
Пептон - 1,0 г
Натрий хлористый - 0,5
г
Лактоза
- 0,5 г
Вода
- 100 куб. см
1,6% спиртного или щелочного раствора - 0,2 куб. см
бромтимолового синего
рН
- 7,4 - 7,6.
Разлить по 5 - 7 куб. см в пробирки с
бродильными трубками (при отсутствии бродильных трубок можно применять комочки
ваты). Стерилизация при 112 +/- 2 °С (0,5 кгс/кв. см)
12 - 15 мин.
7.2.2. Приготовление среды Эндо
Готовят из сухого препарата Дагестанского
НИИ по прописи на этикетке.
7.2.3. Приготовление 1,6-процентного
спиртового раствора бромтимолового синего
1,6 г индикатора бромтимолового синего
растворяют в 100 куб. см спирта ректификованного.
7.2.4. Приготовление 1,6-процентного
щелочного раствора бромтимолового синего
К 1,6 г индикатора бромтимолового синего
добавляют 34,4 куб. см 0,4-процентного едкого натрия. Через час объем доводят
до 100 куб. см дистиллированной водой.
7.2.5. Приготовление реактива для
определения оксидазной активности бактерий
30 - 40 г альфа-нафтола
растворяют в 2,5 куб. см ректификованного этилового спирта, прибавляют 7,5 куб.
см дистиллированной воды и растворяют 40 - 60 мг диметил-п-фенилендиамина.
Раствор готовят непосредственно перед определением.
7.2.6. Приготовление реактивов для
окраски по Граму (модификация МНИИГ им. Ф.Ф. Эрисмана)
Раствор А:
0,5-процентный спиртовой раствор кристаллического фиолетового.
Раствор Б: в 100
куб. см 96° этилового спирта растворить при нагревании в водяной бане 2,0 г
йодистого калия, затем прибавить 1,0 г кристаллического йода и 0,5 г основного
фуксина. Реактив выдержать в термостате при 37 °С 2 -
3 часа во флаконе с притертой пробкой. Хранить во флаконе из темного стекла или
обернутым в черную бумагу, небольшие порции для
повседневного употребления хранить при комнатной температуре, большие объемы в
холодильнике.
7.3. Среды и
реактивы для выделения сальмонелл
7.3.1. Магниевая среда накопления
(разработка МНИИГ им. Ф.Ф. Эрисмана)
Среда готовится из двух растворов.
Раствор А: вода
дистиллированная
- 89,0 куб. см
пептон - 0,42
г
хлористый натрий - 0,7 г
KH PO - 0,15 г
2 4
дрожжевой экстракт - 2,0 куб. см
Раствор Б: вода
дистиллированная
- 9,0 куб. см
хлористый магний
кристаллический - 3,6 г.
После растворения в водяной бане при
кипячении в течение 10 мин. растворы А и Б смешивают и
прибавляют 0,5 куб. см 0,1-процентного водного раствора бриллиантового
зеленого.
7.3.2. Приготовление висмут-сульфитной
среды
Плотную подтверждающую висмут-сульфитную
среду Вильсона и Блера готовят из сухого препарата Дагестанского НИИ по прописи
на этикетке. Среду разливают в чашки Петри за 2 - 3 суток до применения и
хранят в холодильнике.
7.3.3. Двуслойная комплексная среда
ДУКС-5 (разработана Г.П. Калиной)
Среда двуслойная.
Нижний слой: питательный бульон - 100 куб. см
K HPO - 0,1 г
2 4
KH PO - 0,04 г
2 4
глюкоза - 0,1 г
тиосульфат натрия - 0,68 г
агар-агар - 0,6 г.
После растворения при кипячении в водной
бане прибавляют 0,2 куб. см 1,6-процентного щелочного раствора фенолового
красного: 0,6 куб. см 1-процентного водного раствора метиленового синего и 0,8
куб. см 50-процентного водного раствора мочевины. Разливают асептично в
пробирки и остужают в вертикальном положении.
Верхний слой: 2-процентный питательный
агар - 100 г
K HPO - 0,1 г
2 4
KH PO - 0,04 г
2 4
соль Мора - 0,16 г
лактоза и сахароза - по 1 г.
После растворения при кипячении добавляют
0,3 куб. см 1,6-процентного щелочного раствора фенолового красного и 2,0 куб.
см 0,01-процентного водного раствора кристаллического фиолетового. Разливают
поверх нижнего слоя, скашивают, оставив столбик высотой до 1 см.
7.3.4. Приготовление 1,6-процентного
щелочного раствора фиолетового красного
К 1,6 г индикатора фенолового красного
добавляют 34,4 куб. см 0,4-процентного едкого натрия. Через 1 час добавляют
дистиллированной водой до 100 куб. см.
7.4. Среды для выделения
и идентификации парагемолитических
вибрионов. Реактивы, индикаторы
7.4.1. 1-процентная пептонная вода с 3%
хлористого натрия (среда накопления)
Приготовление основного 10-процентного
раствора пептонной воды:
Пептон - 100,0 г
Хлористый натрий -
30,0 г
Азотнокислый калий - 5,0 г
Углекислый натрий - 25,0
г
Дистиллированная вода - 100 куб.
см
рН
- 8,0.
После растворения всех ингредиентов и
кипячения раствор фильтруют через ватно-бумажный фильтр, разливают во флаконы и
стерилизуют при 120 +/- 2 °С (1,1 кгс/кв. см) в
течение 30 минут. Концентрат пептонной воды может храниться в течение 6
месяцев.
Для получения 1-процентной пептонной воды
с 3% NaCl концентрат разводят дистиллированной водой (на 100 куб. см
концентрата - 900 куб. см дистиллированной воды).
1-процентная пептонная вода без
хлористого натрия может быть использована для приготовления пептонной воды
среды накопления и пептонной воды для определения степени галофилии культур.
7.4.2. Среда с вторичными
алкилсульфатами натрия
Щелочной питательный агар с 3% хлористого
натрия - 1000 куб. см
Сахароза
- 1,5%
Моющее средство
"Прогресс" (20-процентный водный - 0,2%
раствор вторичных
алкилсульфатов натрия)
Бромитиловый синий (спирторастворимый) - 0,008%
рН среды
- 7,8.
7.4.3. Среда ТСВ (модификация московской Горсэс):
Вода дистиллированная - 1000 куб. см
Серноватокислый натрий - 10 г
Лимоннокислый натрий - 10 г
Лимоннокислое железо - 1 г
Сухая бычья желчь - 8 г
Сахароза
- 20 г
Углекислый натрий (безводный) - 6 г
Бромтимоловый синий - 0,04 г
Тимоловый синий -
0,04 г
Сухой питательный щелочной агар
<*> - 50 г
Хлористый натрий - 30 г
рН - 8,0 - 8,2.
--------------------------------
<*> Сухой щелочной агар выпускается
Дагестанским НИИ питательных сред г. Махачкалы.
Все компоненты растворяют в 100 куб. см
дистиллированной воды и доводят до кипения, но не кипятят. Готовую среду разливают
без стерилизации в чашки Петри. Цвет среды - зеленый.
7.4.4. Среда Касаткина
Вода дистиллированная - 500 куб.
см
Пептон
- 5,0 куб. см
Дрожжевой экстракт - 20
куб. см
или сухой дрожжевой экстракт - 2,5 г
Карбонат натрия (сода б/водная) - 0,5 г
Хлористый натрий - 15,0 г
Сахароза
- 10 г
Бромтимоловый синий 20 мг
(разводить в 96° спирте
и добавлять по каплям)
Прогресс
- 1 куб. см
Агар-агар
-
7,5 г
рН
- 8,5 - 8,6
стерилизовать при 0,5 атм. 20 мин.
7.4.5.
Среда ДДА (дифференциально-диагностический агар)
(Григорьев с
соавт., 1975)
Вода
дистиллированная - 1000 куб.
см
Щелочной агар МПА 2% <*> - 50 г
Натрий хлористый - 70 г
Сахароза - 15 г
Пенициллин
- 5000 ед.
Препарат "Прогресс" - 2 куб.
см
Бромтимоловый синий 1,6% спиртовый р-р - 10 куб. см
Теллурит калия (1:1000 р-р) - 7,5 куб. см
рН
- 7,8 - 8,2.
--------------------------------
<*> Сухой щелочной агар выпускается
Дагестанским НИИ питательных сред г. Махачкалы.
К расплавленному стерильному щелочному
мясопептонному агару, охлажденному до 50 °С, добавляют
все ингредиенты. Среда имеет сине-зеленый цвет. Среду, не стерилизуя, разливают
в чашки Петри.
Среды для определения биохимических и
биологических свойств парагемолитических вибрионов.
7.4.6. Среда Хью-Лейфсона
Вода дистиллированная - 1000 куб.
см
Пептон
- 2 г
Хлористый натрий для галофильных
вибрионов - 30 г
K HPO
- 0,3 г
2
4
Бромтимоловый синий (1-процентный водный
раствор) - 3 куб. см
Агар-агар
- 3 г
рН - 8,0.
Приготовленную цветную полужидкую среду
разливают в пробирки по 3 куб. см и стерилизуют при 120 +/- 2
°С (1,1 кгс/кв. см) в течение 15 минут. После стерилизации в каждую
пробирку добавляют 10-процентного раствора глюкозы, простерилизованного
фильтрованием или текучим паром, до конечной концентрации 1% (на 3 куб. см
среды 0,3 куб. см 10-процентной глюкозы).
7.4.7. Щелочной мясопептонный агар (ЩМПА)
К 1 л мясопептонного бульона добавляют 20
г агар-агара и 30 куб. см 10-процентного раствора углекислого натрия, кипятят
45 мин., фильтруют, доводят рН до 8,2 - 8,4 и стерилизуют при 120 °С 20 - 30 мин.
Щелочной питательный агар применяется для сохранения выделенных культур
парагемолитических вибрионов и для выращивания культур при определении их
биохимических и биологических свойств.
7.4.8. Среды Гисса для определения
ферментативной активности
Среды Гисса готовят по прописи на
этикетках сухих сред с добавлением 2,5-процентного хлористого натрия или
приготавливают самостоятельно следующим образом. К 1-процентной пептонной воде
с 3-процентным хлористым натрием добавляют 1% испытуемого углевода или спирта и
индикатор. В качестве индикатора может быть использован индикатор Андреде
(1-процентный р-р) или 0,1 (на 100 мл) 1,6-процентного спиртового раствора
бромтимолового синего, рН среда 7,4 - 7,6.
7.4.9. Среда Кларка (для определения
образования ацетилметилкарбинола и кислотообразования)
Пептон
- 0,5 г
Глюкоза - 0,5 г
K HPO
- 0,5 г
2
4
Дистиллированная вода - 100 куб.
см
Хлористый натрий - 30 г
рН
- 7,8.
Ингредиенты растворяют в 80 куб. см
дистиллированной воды, подогревают при помешивании среды в течение 20 минут,
фильтруют через бумажный фильтр, охлаждают и доводят объем дистиллированной
водой до 100 куб. см. Устанавливают рН, среду разливают в стерильные пробирки и
стерилизуют при 112 °С (0,5 кгс/кв. см) 20 мин.
7.4.10. Среда ДАВГ с аминокислотами
(Григорьев с соавт., 1975)
Пептон
- 5,0 г
Натрий хлористый - 30 г
Глюкоза
- 0,5 г
или 40-процентный раствор - 1,0 куб. см
Витамин В 5-процентный раствор - 0,1 куб. см
6
Бромкрезолпурпур 1,6-процентный
раствор - 1 куб. см
Дистиллированная вода - 1000 куб.
см
рН
-
7,8.
Приготовленную среду делят на 3 разных объема. В первую часть вносят 0,5% L-аргинина, во
вторую - 1% DL-лизина, третья без аминокислот служит контролем. Среду разливают
в пробирки по 2 куб. см и стерилизуют при 112 °С (5
кгс/кв. см) 15 мин.
7.4.11. Питательная желатина
К мясопептонному бульону добавляют 10 -
15% (в летнее время концентрацию желатины увеличивают) желатины и растворяют,
нагревая на водяной бане при температуре 40 - 50 °С,
добавляют 3-процентного хлористого натрия, устанавливают рН 7,0 - 7,4. При
кислой и щелочной реакции желатина теряет способность застывать. Затем желатину
фильтруют на водяной бане, разливают в стерильные пробирки и стерилизуют дробно
3 дня текучим паром или при 112 °С (0,5 кгс/кв. см) 15
минут.
7.4.12. Среда Вагатцума
Дрожжевой экстракт - 0,3
куб. см
Бактопептон (Дифко) - 1 г
Хлористый натрий - 7 г
Маннит
- 1 г
K HPO
- 0,5 г
2
4
Агар-агар
- 1,5 г
Кристаллический фиолетовый - 0,01 г
Кровь человека - 5
куб. см
Дистиллированная вода - 100 куб.
см.
7.4.13. Кровяной агар (Григорьев Ю.И. и
соавт., 1975)
Щелочной агар (МПАэ) - 100 куб.
см
K HPO
- 0,5 г
2
4
Хлористый натрий - 7 г
Маннит - 1,0 г
Кристаллический фиолетовый - 0,5 г
Кровь человека - 5
куб. см
рН
- 8,0.
При приготовлении указанных сред
перечисленные вещества растворяют при нагревании (но не стерилизуют), после
чего добавляют 1% маннита, 0,01% спиртового раствора кристаллического
фиолетового и 5% дефиринированной крови кролика или человека. Среду разливают в
чашки и подсушивают в термостате.
7.4.14. Реактив Эрлиха (для определения
образования индола)
Аминобензальдегид - 4 г
Параметиламинобензальдегид - 4 г
96° этиловый спирт - 380
куб. см
Концентрированная соляная кислота - 8 куб. см.
7.4.15. Реактив Ковача (для определения
образования индола)
Парадиметиламинобензальдегид - 5 г
Изоамиловый спирт - 75
куб. см
Соляная кислота - 80
куб. см.
7.4.16. Приготовление раствора метилового
красного
К 1 куб. см 1,6-процентного спиртового
раствора метилового красного прибавляют 39 куб. см спирта. Раствор сохраняется
длительное время.
7.4.17. Приготовление индикатора Андреде
1 г кислого фуксина растворяют в 32 куб.
см нормального раствора гидрата окиси натрия, прибавляют 200 куб. см
дистиллированной воды, настаивают 24 часа при 37 °С,
фильтруют, стерилизуют 5 мин. при 100 °С. Хранят во флаконе из темного стекла с
притертой пробкой.