Утверждены
Минздравом СССР
28 декабря 1982 г. N 2647-82
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ТРИХЛОРМЕТАФОСА-3 И ЕГО
МЕТАБОЛИТОВ
В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ
Краткая характеристика трихлорметафоса-3
(ТХМ-3) приведена в Унифицированной методике. ДСД трихлорметафоса-3 - 0,01
мг/кг. Содержание в продуктах животноводства не допускается. При метаболизме
ТХМ-3 в организме теплокровных образуются хлорфенолы
различной степени хлорирования (моно-, ди-, трихлорфенолы). Главным
метаболитом является 2,4,5-трихлорфенол (2,4,5-ТХФ), который токсичнее ТХМ-3 в
2 - 3 раза. Кроме того, образуются 2,4-дихлорфенол (2,4-ДХФ) и орто-хлорфенол (о-ХФ). Т. пл. 2,4,5-ТХФ 68 °C, т. кип. 246
°C, т. пл. 2,4-ДХФ 45 °C, т. кип. 210 °C, т. пл. о-ХФ 7 °C (альфа) и 0 °C
(бета), т. кип. 175,6 °C. 2,4,5-ТХФ и 2,4-ДХФ - белые кристаллические вещества,
о-ХФ - жидкость. Хлорфенолы, особенно о-ХФ, обладают
неприятным запахом. Хорошо растворимы в спирте, эфире,
бензоле, растворимость в воде при 20 °C составляет для 2,4,5-ТХФ до 0,1%, для
о-ХФ - до 3%.
Принцип метода. Метод основан на
извлечении остатков ТХМ-3 и хлорфенолов из проб
биоматериала (печень, почки, головной мозг, мышцы, кровь, кал, моча) смесью
органических растворителей - хлористого метилена и гексана
(2:1) с добавлением этилового спирта; концентрировании экстракта и последующем
определении на газовом хроматографе с ДЭЗ или ДПР. Высокая селективность
детектора и малые навески проб позволяют избежать при анализе стадии очистки
экстрактов без ухудшения работы колонки в течение длительного времени (около
3000 анализов).
Метрологическая характеристика метода.
Нижний предел определения ТХМ-3 0,3 мг/кг, хлорфенолов
0,1 мг/кг, минимально детектируемое количество ТХМ-3 0,2 нг,
хлорфенолов 0,1 нг. Среднее
значение определения 85,0 +/- 2,8 (при p = 0,95).
Избирательность метода. Определению не
мешают другие ХОП и ФОП. На колонке с полиэтиленгликольадипинатом
определению ТХМ-3 мешает трихлорметафос. Метод применим
для анализа гомогената крови, гомогенатов
печени, головного мозга, почек, мышц, а также кала и мочи.
Реактивы и растворы. Хлористый метилен х.ч. н-Гексан х.ч.
Натрия сульфат безводный х.ч. или ч.д.а.
Твердый носитель для ГЖХ - хезасорб AW или хезасорб W, хроматон N-AW (0,16 -
0,20 мм). Жидкая фаза - SE-30 или XE-60, OV-17, DC-200, ПФМС-4 и другие
аналогичные, полиэтиленгликольадипинат (ПЭГА).
Газ-носитель - аргон (чистый) или азот особой чистоты. Стекловата. Сахароза.
Стандартные растворы ТХМ-3 и хлорфенолов в н-гексане: 10 мг вещества растворяют в мерной колбе на 100 мл
в небольшом количестве гексана, раствор доводят до
метки, хорошо перемешивают, плотно закрывают и хранят в холодильнике.
Приборы и посуда. Хроматограф с ДЭЗ или
ДПР. Гомогенизатор стеклянный или микроизмельчитель
тканей. Пипетки на 1; 2 и 10 мл. Колбы мерные на 100 мл. Стакан мерный на 200
или 300 мл. Воронки делительные на 50 или 100 мл. Пробирки химические.
Ротационный испаритель ИР-1. Пробирки центрифужные с
делениями для приготовления разбавленных стандартных растворов. Колбы
круглодонные на 50 мл.
Подготовка к определению. Заполнение и
подготовка к анализу газохроматографической колонки. Если отсутствует набивка
колонки заводского приготовления, жидкую фазу на сорбент можно нанести
самостоятельно. Для этого взвешивают необходимые количества твердого носителя и
жидкой фазы. Сорбент (20 г) помещают в круглодонную колбу, заливают 100 мл
хлороформа. Жидкую фазу смывают в ту же колбу микроколичеством
хлороформа. Растворитель отгоняют под вакуумом при нагревании на водяной бане и
непрерывном помешивании. Подготовленный носитель высушивают на фильтровальной
бумаге в течение 12 ч и хранят в склянке с притертой пробкой.
Ход анализа. Экстракция и
концентрирование экстрактов. Готовят 10-процентный гомогенат
ткани (печени, почек, головного мозга, мышц, крови) в 0,25 М растворе сахарозы.
Для анализа берут 1 мл гомогената.
Мочу берут в количестве 0,2 - 5 мл, кал 1
- 5 г; 1 мл гомогената, мочу или
кал переносят в делительную воронку на 50 или 100 мл, прибавляют 1 мл этилового
спирта и экстрагируют 4 мл смеси растворителей - хлористого метилена с гексаном (2:1) трижды, каждый раз отстаивая смесь в течение
10 - 15 мин. Перед экстрагированием твердые кусочки кала разбивают стеклянной
палочкой, экстрагирование кала можно проводить непосредственно в пробирке.
Экстракты объединяют, сушат в течение 1 ч безводным сульфатом натрия. Экстракты
сливают в чистые пробирки, а отработанный сульфат натрия три раза ополаскивают
свежими порциями растворителя по 3 - 5 мл и присоединяют растворитель к
основному экстракту.
Экстракт упаривают при комнатной
температуре досуха, на что уходит обычно 3 - 4 дня, или отгоняют на ротационном
испарителе. Остаток в колбе смывают 1 мл гексана в
пробирку. При естественном упаривании к сухому остатку в пробирке прибавляют 1
мл гексана, обмывая стенки пробирки, и количественно
определяют на хроматографе.
Условия
хроматографирования. Хроматограф
"Цвет-106" или любой
другой с ДЭЗ
или ДПР. Колонка стеклянная длиной 1 м с внутренним
диаметром 3 мм.
Наполнение колонки: хроматон N-AW (0,16 - 0,20 мм)
+ 5%
SE-30. Температура колонки
180 °C, испарителя - 210 °C.
Расход газа-носителя
через колонку 35 мл/мин., скорость потока
-12
продувочного газа -
150 мл/мин. Шкала электрометра 20 x 10
А.
Скорость протяжки
ленты 600 мм/ч.
Объем вводимой пробы 1 мкл.
Время удерживания:
ТХМ-3 - 3 мин. 39 с, 2,4,5-ТХФ - 1 мин. 12 с,
2,4-ДХФ - 34 с,
о-ХФ - 20 с.
При
использовании колонки с ПЭГА применяют
ДЭЗ или ДПР.
Колонка стеклянная
длиной 1 м с внутренним
диаметром 3 мм,
наполненная хроматоном N-AW (0,16
- 0,20 мм)
с 10% ПЭГА.
Температура колонки
190 °C, испарителя
и детектора - 220 °C.
Расход газа-носителя
(аргона) через колонку
43 мл/мин. Шкала
-12
электрометра 20
x 10 А. Скорость протяжки ленты 600
мм/ч. Объем
вводимой пробы 1
мкл.
Время удерживания на колонке с ПЭГА в
этих условиях составляет: ТХМ-3 - 9 мин. 12 с, 2,4,5-ТХФ - 3 мин. 25 с, 2,4-ДХФ
- 1 мин. 25 с, о-ХФ - 42 с.
Идентификация ТХМ-3 и хлорфенолов.
Идентификацию проводят по времени выхода веществ в сравнении
со стандартными растворами или путем добавок метчиков к экстрактам проб и
повторного хроматографирования. Для повышения
надежности идентификации используют колонку с фазой противоположной полярности,
например с ПЭГА. Такая колонка особенно полезна для подтверждения идентификации
хлорфенолов, имеющих на
колонке с SE-30 короткое время выхода, особенно о-ХФ.
Обработка результатов анализа.
Количественную обработку результатов проводят методом абсолютной калибровки по
заранее построенным градуировочным графикам. Для
этого вводят в хроматограф по 1 мкл стандартных
растворов ТХМ-3 и хлорфенолов в гексане,
содержащих 0,5; 1; 5 и 10 мкг/мл (каждого 3 - 5 раз) или 1; 2; 3; 5 и 10 мкл растворов определенной концентрации. По полученным
данным строят график зависимости высот (или площадей) пиков от количества введенного
пестицида.
Во время проведения анализов калибровку
проверяют 1 - 2 раза в день. Измерив высоту пика (или площадь) определяемого
вещества, по графику находят количество его в пробе. Расчет количества
пестицидов в пробе (X, мг/кг или мг/л) проводят по формуле:
CVV
1
X = -----,
V PV
0 2
где:
C - количество пестицида, найденное по
калибровочному графику,
нг;
V
- объем экстракта,
из которого отбирают
аликвоту
для
дозирования в
хроматограф, мл;
V -
объем аликвоты, вводимой в
хроматограф, мкл;
0
P - навеска пробы, г
(для мочи мл);
V -
общий объем гомогената, мл;
1
V -
объем гомогената, взятый для анализа, мл.
2
При
анализе мочи и кала выражение V /
V в
расчетах не
1 2
используется.
Требования безопасности. Соблюдают
правила безопасности, обычно рекомендуемые для химических лабораторий при
работе с легковоспламеняющимися жидкостями, горючими и огнеопасными веществами,
а также сосудами высокого давления (сжатыми газами).