Утверждаю
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача СССР
А.И.ЗАИЧЕНКО
28 января 1980 г. N 2144-80
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ИЗОФОСА-3 В
РИСЕ, ПОЧВЕ
И ВОДЕ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ И ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ
Настоящие Методические указания
предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и
научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных,
агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза СССР и
лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных
количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней
среде.
Методические указания апробированы и
рекомендованы в качестве официальных группой экспертов при Госкомиссии по
химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками при
МСХ СССР.
Методические указания согласованы и
одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы
ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского
и лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении
Минздрава СССР.
1. Краткая характеристика препарата
Изофос-3 - новый отечественный гербицид,
рекомендуемый для борьбы с просовидными сорняками в посевах риса. Действующее
начало препарата - O-(2-хлор,4-метилфенил)-N-(втор-бутиламидо)хлорметилтиофосфонат.
Структурная формула:
ClCH S
\ // Cl
P ---
/ \ //
\\
втор-CC H NH O CH C H ONPSCl
4 9 \ ___ /
3 12
18 2
--- Мол. масса 326,0.
Синонимы отсутствуют.
В чистом виде - бесцветная вязкая
жидкость с Т кип. 147 - 148 °С при 0,1 мм рт. ст.
Хорошо растворим в ацетоне, гексане, бензоле,
этилацетате. Растворимость в воде при 20 °С 1,87 мг/л. Р-значения в системе вода:органический растворитель для
гексана 0,84, этилацетата 0,71, бензола 0,90.
ЛД
для крыс 510 мг/кг.
50
ДОК в рисе 0,1 мг/кг, ПДК в воде 0,4
мг/л. ПДК в почве не установлена.
2. Методика определения изофоса-3 в рисе,
почве и воде газожидкостной и тонкослойной хроматографией
2.1. Основные положения
2.1.1. Принцип метода
Метод определения
изофоса-3 в рисе основан на извлечении гербицида этилацетатом, из воды - гексаном, а из почвы - смесью гексана
с ацетоном (4:1) или изопропилового спирта с бензолом (1:2) и определении
газожидкостной хроматографией с термоионным детектором (ТИД) без очистки
экстракта или тонкослойной хроматографией после очистки экстракта на колонке с
окисью кремния для люминофоров.
2.1.2. Метрологическая характеристика
метода
Диапазон определяемых концентраций:
ГЖХ ТСХ
рис 0,03 - 0,48 мг/кг 0,05 - 0,3 мг/кг
почва 0,01 - 0,16 мг/кг 0,05 - 0,3 мг/кг
вода 0,005 - 0,08 мг/л 0,001 - 0,006 мг
Предел обнаружения 0,25 мг ГЖХ и 0,5 мкг
ТСХ.
Предел обнаружения:
ГЖХ ТСХ
рис 0,03 мг/кг 0,05 мг/кг
почва 0,01 мг/кг 0,05 - 0,08 мг/кг
вода 0,005 мг/л 0,001 мг/л
Среднее значение определения стандартных
количеств изофоса-3 в % С при
п = 15:
ГЖХ ТСХ
рис 90,8 83,2
почва 85,9 81,0
вода 95,0 90,0
Стандартное отклонение S в
%:
ГЖХ ТСХ
рис +/- 3,5 +/- 9,4
почва +/- 7,9 +/- 8,8
вода +/- 3,9 +/- 7,8
Относительное стандартное отклонение S :
2
ГЖХ ТСХ
рис +/- 3,9 +/- 11,3
почва +/- 9,1 +/- 10,9
вода +/- 4,1 +/- 8,7
Доверительный интервал среднего в % при р = 0,95 и п = 5:
ГЖХ ТСХ
рис 90,<...> +/- 4,5 83,2 +/- 12,1
почва 85,9 +/- 10,2 81,0 +/- 11,3
вода 95,0 +/- 5,0 90,0 +/- 10,0
Размах варьирования в % R:
ГЖХ ТСХ
рис 73 - 98 70,0 - 90,5
почва 72 - 99 70 - 90
вода 82 - 100 80 - 100
2.1.3. Избирательность метода
Метод селективен.
Прочие пестициды, применяемые на рисовых плантациях, в том числе рицид, рицид-П, ялан, пропанид, метафос, определению не мешают.
2.2. Реактивы и материалы
Ацетон, ГОСТ 2603-71, хч,
свежеперегнанный.
Гексан, ТУ-6-09-3375-78, хч, свежеперегнанный.
Бензол, ГОСТ 5955-75.
Изопропиловый спирт, СТ-ГОХП 15-235, хч.
Хлористый метилен, МРТУ 6-09-53-62-68, хч, свежеперегнанный.
Петролейный эфир (фр. 40 - 70 °С), ТУ-МХП 1867-48, ч, перегнанный.
Кремний окись (IV) для люминофоров,
МРТУ-6-69-485-67.
Окись кремния
просеивают через сито с размером отверстий 0,2 мм (70 -
90 меш). 100
г сорбента помещают
в фарфоровую чашку
и активируют в
предварительно нагретом
шкафу до 130 °С
в течение 7
часов. Сорбент
охлаждают в
эксикаторе над P O , затем пересыпают в круглодонную колбу на
2 5
500 мл
с притертой пробкой
(колба 1). Колбу 1 хранят в
эксикаторе без
осушающего агента.
В колбу 2
быстро отвешивают из
колбы 1 47,5 г
активированного охлажденного
сорбента, затем пипеткой очень
аккуратно по
стенкам колбы
вносят 2,5 мл
дистиллированной воды. Колбу
закрывают
притертой пробкой
и ее содержимое тщательно встряхивают в течение 15 - 20
мин. до
исчезновения комков. Колба 2 хранится в эксикаторе без осушающего
агента. Сорбент
из колбы 2 годен к употреблению в течение 6 - 7 дней.
2,6-Дибромхинонхлоримид, МРТУ
6-09-5759-69, 0,5-процентный раствор в циклогексане.
Циклогексан, МРТУ 6-09-3112-66, хч.
Азотнокислое серебро, ГОСТ 1277-75.
Бромфеноловый синий.
Проявляющий бромфеноловый
реагент. 0,05 г бромфенолового синего растворяют в 10
мл ацетона и доводят до 100 мл 1-процентным раствором азотнокислого серебра в
смеси ацетона с водой (3:1).
Уксусная кислота, ГОСТ 61-75,
5-процентный водный раствор.
Хроматон-N-супер (0,16 - 0,20 мм) с 3% SE-30.
Хроматон-N-AW-НМДS (0,125 - 0,160 мм).
Полидиэтиленгликольсукцинат (ПДЭГС), ТУ 6-11-15-68.
Пластинки "силуфол",
ЧССР.
Хлористый натр, ГОСТ 4233-66, чда.
Пятиокись фосфора
P O , МРТУ 6-09-5759-69.
2 5
Сульфат натрия, ГОСТ 41-66-76, безводный
и 1-процентный раствор.
Стандартные растворы изофоса-3 в ацетоне
с содержанием 100 мкг/мл (раствор А), 10 мкг/мл (раствор Б) и серия стандартных
растворов с содержанием 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 мкг/мл.
Раствор А
готовят растворением 10 мг изофоса-3 в мерной колбе на 100 мл в ацетоне. Из
раствора А пипеткой отбирают 10 мл и помещают в мерную
колбу на 100 мл и доводят колбу до метки ацетоном (раствор Б). Растворы А и Б стабильны при хранении в холодильнике в течение 1
года.
Для приготовления серии стандартных
растворов из раствора Б в серию пробирок емкостью 10
мл с пришлифованными пробками пипеткой отбирают 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 мл
и соответственно добавляют пипеткой 9,9; 9,8; 9,5; 9,0; 8,0; 7,0 мл ацетона.
Пробирки закрывают пробками. Серию стандартных растворов готовят ежедневно.
Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74,
газообразный из баллона.
Водород из баллона с редуктором или
получаемый из генератора водорода.
Воздух из баллона или нагнетаемый
компрессором.
2.3. Приборы, аппаратура, посуда
Хроматограф Цвет-106 или аналогичный
прибор с ТИД.
Хроматографическая камера с притертой крышкой.
Аппарат для встряхивания.
Кофейная мельница.
Ротационный вакуумный испаритель.
Почвенное сито.
Сито с размером отверстий 0,2 мм (70 - 90
меш).
Делительные воронки, ГОСТ 10054-75, на 1
л.
Хроматографическая колонка стеклянная длиной 20 см, внутренним диаметром 1 см с пористым
фильтром в нижней части и с капельницей на шлифе.
Хроматографические колонки для ГЖХ стеклянные длиной 2 м и внутренним диаметром 3,5 мм,
а такте длиной 1,5 м и внутренним диаметром 3 мм.
Колбы плоскодонные со шлифом, ГОСТ
10394-72, на 100, 500 и 1000 мл.
Мензурки, ГОСТ 1770-74, на 50, 100 и 500
мл.
Эксикатор.
Пипетки, ГОСТ 1770-74, на 1, 2, 10 и 25
мл.
Колбы мерные, ГОСТ 1770-74, на 100 мл.
Пробирки с притертыми пробками на 10 мл.
Микрошприц на 10 мкл.
Пористый фильтр N 1.
2.4. Подготовка к определению
Подготовку хроматографа к работе проводят
согласно инструкции.
Хроматографические камеры насыщают "подвижным растворителем" гексан:хлористый метилен (3:2) или
петролейный эфир:ацетон
(7:1) в течение 1 часа.
Перед анализом рис измельчают на кофейной
мельнице до консистенции муки грубого помола. Для анализа берут 50 г.
Почву перед анализом просеивают через
почвенное сито. Для анализа берут навеску почвы в естественно-влажном состоянии
в количестве 20 г.
2.5. Проведение определения
Газохроматографическое определение
Рис. 50 г размолотого риса помещают в
плоскодонную колбу на 1 л, добавляют 100 мл этилацетата и экстрагируют изофос-3
с помощью механического встряхивания в течение 30 мин. Экстракт фильтруют через
бумажный фильтр в круглодонную колбу прибора для отгонки растворителя.
Экстракцию повторяют еще два раза тем же количеством растворителя. Отгоняют
этилацетат с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью. К сухому
остатку пипеткой добавляют 10 мл ацетона. Колбу закрывают притертой пробкой и
тщательно обмывают стенки колбы растворителем. В хроматограф вводят 2 мкл полученного раствора.
Вода. 500 мл воды помещают в делительную
воронку емкостью 1 л, добавляют около 10 г хлористого натрия и экстрагируют
изофос-3 тремя порциями по 100 мл этилацетата. Объединенный экстракт сушат над
безводным сульфатом натрия и фильтруют через пористый фильтр N 1 в круглодонную
колбу прибора для отгонки растворителя. Фильтр смывают небольшим количеством
этилацетата. С помощью ротационного вакуумного растворителя полностью удаляют
растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 2 мл ацетона, колбу закрывают
пробкой и тщательно смывают стенки колбы растворителем. В хроматограф вводят 2 мкл полученного раствора.
Почва. Среднюю пробу почвы (20 г)
помещают в плоскодонную колбу на 100 мл, заливают 50 мл смеси гексан:ацетон (4:1) или
изопропиловый спирт:бензол (1:1) и экстрагируют
изофос-3 в течение 30 мин. с помощью механического встряхивания. Переносят
экстракт через бумажный фильтр в делительную воронку. Операцию повторяют еще
два раза тем же количеством растворителя. К объединенному экстракту добавляют
30 мл 1-процентного раствора сульфата натрия, 50 мл ацетона и несколько раз
осторожно, не взбалтывая, переворачивают воронку, предварительно закрыв ее
пробкой. После разделения слоев водный нижний слой отбрасывают.
Верхний слой сливают в коническую колбу
на 500 мл и сушат над безводным сульфатом натрия в течение 15 - 20 мин. при
периодическом помешивании раствора. Высушенный экстракт фильтруют небольшими
порциями в грушевидную колбу на 25 мл и отгоняют растворитель с помощью
ротационного вакуумного испарителя до объема 1 - 2 мл. Последнюю порцию
растворителя удаляют полностью. К сухому остатку пипеткой добавляют 2 мл гексана. Колбу закрывают притертой пробкой, тщательно
смывают стенки колбы растворителем. В хроматограф вводят 2 мкл
полученного раствора.
Условия хроматографирования
Хроматограф
Цвет-106 с ТИД
Наполнитель
колонки 3% SE-30 на 2% ПДЭГС на
хроматоне-N-супер хроматоне-N-AW-НМДS
Двина
колонки 200 см 150 см
Диаметр 3,5 мм 3 мм
Скорость
протяжки ленты самописца 0,33
см/мин. 0,33 см/мин.
-10 -10
Рабочая шкала
электрометра 10 х 10 А 2 х 10 А
Температура
колонки 210 °С 180
°С
испарителя 220 °С 190 °С
Скорость
азота 60 мл/мин. 75 мл/мин.
водорода 18 мл/мин. 18 мл/мин.
воздуха 180 мл/мин. 180 мл/мин.
Время
удерживания изофоса-3 3 мин. 35
с 9 мин. 25 с
ялана 23 с 30 с
рицида 1 мин. 6 с 3 мин. 42 с
рицида-П 1 мин. 16 с 2 мин. 27 с
метафоса 1 мин. 29 с 11 мин. 3 с
пропанида 1 мин. 50 с 19 мин. 2 с
(при 210°)
В хроматограф
вводят 2 мкл 2 мкл
Линейность
детектирования 0,25 - 4 нг 0,3 - 5 нг
Количественное определение проводят
методом соотношения со стандартом по высоте пиков.
Определение тонкослойной хроматографией
При определении методом ТСХ дополнительно
проводят очистку экстракта на колонке с окисью кремния для люминофоров. Для очистки
берут аликвоты из полученных по п. 2.6.1 конечных
растворов.
Рис. Из 10 мл на очистку берут 2 мл, что
эквивалентно 10 г риса.
Почва. К 2 мл добавляют еще 2 мл гексана и на очистку в зависимости от содержания гумуса
(<= 4%) берут 1 или 2 мл полученного раствора, что эквивалентно 5 или 10 г
почвы.
Вода. На очистку берут весь объем (2 мл)
раствора.
Отобранную ацетоновую
аликвоту помещают в пробирку, полностью
удаляют
растворитель. К
сухому остатку пипеткой добавляют 2 мл гексана.
Раствор
почвенной пробы,
поскольку она растворена
в гексане, непосредственно
переносят на
колонку. Полученные растворы также переносят на колонку. Для
подготовки колонки отвешивают в химический стакан 5 г
сорбента из колбы 2,
добавляют к
нему гексан, содержимое
стаканчика быстро перемешивают и
переносят на
колонку. Предварительно на
пористый фильтр колонки помещают
небольшой ватный
тампон. Колонку заполняют
при открытом кране.
Кран
закрывают, когда растворитель находится над слоем
сорбента на расстоянии 3
мм. Меняют приемник и
при открытом кране колонки переносят рабочий раствор
(2 мл).
Дают ему полностью
впитаться в сорбент. Колбу из-под
рабочего
раствора несколько
раз ополаскивают 1 - 2 мл гексана, полученный раствор
также переносят
на колонку. К колонке присоединяют капельницу, содержащую
20 мл
смеси хлористого метилена
с гексаном
(4:1) и по каплям начинают
добавлять элюат. По окончании элюирования отсоединяют
приемник, добавляют
к элюату чайную ложку
безводного сульфата натрия и сушат раствор в течение
нескольких мин. Элюат фильтруют в центрифужную
пробирку. В пробирку
помещают заплавленный в верхней части капилляр и отгоняют на
водяной бане
растворитель, добавляя
свежие порции фильтрата
по мере
удаления
растворителя. Остаток
(0,1 - 0,2 мл) при помощи того же капилляра, но с
отломанным заплавленным концом
количественно переносят на
хроматографическую
пластинку. Одновременно с рабочей пробой на пластинку
наносят серию стандартных растворов изофоса-3 с
содержанием 0,5; 1,0; 1,5;
2,0; 3,0
мкг. Хроматограмму
развивают в системе гексан:хлористый
метилен
(3:2) или
в системе петролейный эфир:ацетон (7:1).
После развития
хроматограммы
ее высушивают и обрабатывают 0,5-процентным раствором
2,6-дибромхинонхлоримида в
циклогексане с последующим
нагреванием в
сушильном шкафу
при температуре 40 °С в течение 5 мин. Изофос-3
проявляется
на пластинах
в виде оранжевых
пятен на белом фоне с R 0,44 +/-
0,01 в
f
первой системе
и 0,56 +/-
0,09 - во второй. Пятна стабильны
в течение
длительного времени.
Хроматограммы
можно также проявлять бромфеноловым
реагентом с
последующим снятием фона
5-процентным раствором уксусной
кислоты.
2.6. Расчет результатов анализа
Газожидкостная хроматография
Содержание изофоса-3 в анализируемой
пробе вычисляют по формуле:
Н х С х V
рп ст
С = -------------, мг/кг
или мг/л,
Н х V х А
ст а
где:
Н -
высота пика анализируемой пробы в мм;
рп
Н -
высота пика стандарта в мм;
ст
С -
содержание изофоса-3 в стандарте в мг;
ст
V
- объем конечного
раствора, из которого
отбирают аликвоту на
хроматографирование в мл;
V -
объем аликвоты, вводимой в
хроматограф в мкл;
а
А - навеска анализируемого образца почвы в г или объем воды в мл.
Если при введении в хроматограф
получаются слишком большие пики или происходит "зашкаливание",
готовят менее концентрированные растворы, добавляя в конечный объем
дополнительное замеренное количество растворителя.
Тонкослойная хроматография
Содержание изофоса-3 в анализируемой
пробе вычисляют по формуле:
С
рп
С = ---, мг/кг или
мг/л,
А
где:
С
- количество изофоса-3,
найденное в хроматографируемой пробе, в
рп
мкг;
А -
навеска анализируемого образца риса или почвы в г или объем воды в
мл.
3. Требования безопасности
При работе соблюдать требования
безопасности, принятые для фосфорорганических соединений, легковоспламеняющихся
жидкостей и при работе с водородом.
4. Литература
1. Ф.Р. Мельцер,
К.Ф. Новикова, Т.В. Алдошина "Определение остаточных количеств новых
отечественных гербицидов изофоса-2, изофоса-3 в рисе и воде методом газожидкостной
хроматографии с термоионным детектором" в сб. "Газовая хроматография
пестицидов", Таллин, 1972 г, 178 - 185.
2. Ф.Р. Мельцер,
К.Ф. Новикова, Т.В. Алдошина "Определение изофоса-2, изофоса-3, рипида и ялана в рисе и воде
ГЖХ" в книге "Методы определения микроколичеств
пестицидов", М., "Колос", 1977, 219 - 222.
5. Авторы
Методические указания разработаны
авторским коллективом ВНИИ химических средств защиты растений, г. Москва, К.Ф.
Новиковой, Ф.Р. Мельцер, Т.В. Алдошиной, И.Л.
Меерзон.
6. В настоящие Методические указания
включена методика определения остаточных количеств изофоса-3 в почве методом
ГЖХ и ТСХ, разработанная тем же коллективом авторов и утвержденная 18 ноября
1977 г. N 1798. Методика опубликована в "Методических указаниях по определению
микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах
и внешней среде", ч. IX, 1979 г., стр. 120 - 124.